Мир науки

Рефераты и конспекты лекций по географии, физике, химии, истории, биологии. Универсальная подготовка к ЕГЭ, ГИА, ЗНО и ДПА!

Загрузка...

Другим подходом, который используется для точной локализации белка на фрагменте ДНК

, является футпринтинг ДНК (DNA footprinting). Принцип метода схематично изображено на рис. 11.16. Конец одной из цепей метят радиоактивной меткой. Обычно 32Р в составе фосфатного остатка присоединяется к предварительно дефосфорильованих 5'-концов полинуклеотидкиназою, после чего один из концов фрагмента отрезается рестриктаз (аналогично соответствующему этапу процедуры на рис. 11.12). Если внести в эту ДНК ограниченное количество одноцепочечных разрезов (например, один разрез на фрагмент в среднем), получим случайный набор меченых фрагментов разной длины, можно разделить с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях.

Как агенты вносят разрывы, чаще всего используют ДНКазы I или гидроксил-радикалы: оба агента разрезают один из цепей ДНК через маленький желобок. В случае, когда фрагментом ДНК взаимодействует белок, ДНК оказывается защищенной в сайте взаимодействия: на геле после электрофореза можно увидеть зону, где отсутствуют полосы ДНК, или интенсивность полос ниже по сравнению с контрольным результатом деградации свободной ДНК. Длины верхней и нижней полос, окружающих эту зону, являются границами сайта взаимодействия относительно метки.

Аналогичный подход в сочетании с блот-гибридизацией (так называемое косвенное конечное мечение) позволяет установить степень защищенности ДНК белками в конкретных геномных зонах. Первым этапом процедуры является ограниченная деградация ДНК нуклеаз в клеточных ядрах. После этого выделяют суммарную ДНК и обрабатывают ее рестриктаз: в результате препарат содержит фрагменты ДНК от рестриктного сайта к месту разреза нуклеаз. Все эти фрагменты разделяющими путем электрофореза, осуществляющих блотинга и обрабатывают нитроцеллюлозный фильтр радиоактивно меченым зондом до определенного участка генома. На авторадиограми визуализируются (или нет, если ДНК защищена белком) фрагменты ДНК из этой зоны.



Загрузка...
Загрузка...
Яндекс.Метрика
Биология      Физика      Химия      Экономика     География
Микробиология      Теоретическая механика     География Белоруссии    География Украины    География Молдавии
Растительность мира      Электротехника    География Грузии    География Армении    География Азербайджана
География Казахстана    География Узбекистана    География Киргизии    География Туркменистана    Природоведение
География Таджикистана    География Эстонии