Факторы, которые индуцируют апоптоз. Апоптоз контролируется системой соответствующих сигналов от внутренних (эндогенных) и внешних (экзогенных) факторов, которые воспринимаются через так называемые
рецепторы «смерти». Сигналы, которые могут приводить к развитию апоптоза, называют апоптогеннимы, или проапоптичнимы, стимулами.
Важнейшими эндогенными стимулами, запускающие апоптоз, является неправильный ход клеточного цикла, наличие вирусного поражения, наличие в клетке фрагментов поврежденной ДНК, «излишек» митогеном факторов.
Экзогенные стимулы, приводящие к апоптозу, представляют собой различные сигналы, поступающие к рецепторам клеток, например сигнал от рецепторов ФНО-семьи (Fas-, ФНО-рецептора и т.п.). Одним из важных механизмов контроля за ростом клеточных популяций зависимость клеток от сигналов, поступающих из клеточного микроокружения. Клетки, которые не получают этих сигналов, например в случае, если они попали в другой микроокружения, погибают щлях апоптоза. Поэтому к апоптозу могут приводить определенные митогенного стимулы, если они действуют в избыточном количестве или клетка не готова к их восприятию. С другой стороны, отсутствие нужных ростовых факторов также приводит к апоптотической гибели активированной клетки. Среди внешних факторов, которые могут приводить к апоптозу, следует также назвать ряд повреждающих воздействий, таких как токсины, радиация, УФ-облучение, воздействие сублетальных температур, механические повреждения. В случае сильно выраженного влияния эти факторы вызывают некроз тканей, при слабом - апоптоз отдельных клеток. Рецепторы «смерти» и их лиганды. Рецепторы «смерти», взаимодействие которых с соответствующими лигандами приводит к запуску апоптоза, являются членами суперродины рецепторов фактора некроза опухолей ФНПР. Важнейшим и поэтому хорошо изученным рецептором «смерти» является Fas (CD95/APO-1). К рецепторам семьи ФНО-Р кроме Fas относятся собственно рецепторы к фактору зу опухолей ФНО-Р1 и ФНО-Р2, а также многие другие молекул: CD30, CD40, фактор к фактору роста нервов ФРГ-Р т.д.. Рецепторы «смерти» характеризуются наличием 60 - 80-го аминокислотного цитоплазматического домена, который называют доменом «смерти» (DD - от англ. Death domein). Для эффективного инициирования сигнала «смерти» от мембраны клетки нужна тримеризация рецепторов, что и происходит при связывании рецепторов с соответствующими лигандами или агонистического антителами. После связывания рецептора домены «смерти» ассоциируются с определенными адапторной молекулами и таким образом инициируется сигнал к запуску программы апоптоза.
Оказалось, что к физиологическим лигандом к рецептору Fas является белок Fas-лиганд (FasL), который экспрессируется на поверхности клеток с цитотоксической функцией. Некоторые клетки могут экспрессировать как рецептор Fas, так и Fas-лиганд и таким образом самоуничтожаться.
Мембранная форма белка Fas представлена почти на всех клетках организма, которые способны к делению. Это позволяет клеткам иммунной системы индуцировать в случае необходимости апоптоз в своих «мишеней». Особенно плотно молекула Fas экспрессированных на клетках в кишечнике, тимусе, печени, легких и т.д.. Основное назначение мембранного Fas - это запуск программы апоптоза с клеточной поверхности. Однако в последнее время появились данные о некоторые другие функции Fas. В частности, было показано, что связывание Fas на мембране полиморфноядерных нейтрофилов приводит к хемотаксиса этих клеток. Более того, в некоторых случаях Fas может выступать как рецептор к ростовых факторов. Гликопротеин Fas может существовать как в ассоциированной с мембраной (mFas), так и в растворимой (sFas) формах. Растворимый форма Fas образуется путем альтернативного сплайсинга и может существовать в виде нескольких изоформ. Растворимый форма рецептора взаимодействует с Fas-лигандом на поверхности цитотоксических клеток и таким образом нейтрализует последние. Считают, что в некоторых случаях с помощью секреции растворимой формы Fas-рецептора опухолевые клетки избегают иммунного контроля.
Физиологический лиганд к рецептору Fas (FasL, CD95L) является трансмембранным белком с молекулярной массой 40 кДа, который экспрессируется в виде тройного. FasL является членом семьи цитокинов, включая фактор некроза опухолей а (ФНО-а), лимфотоксины а и ß, CD30L, CD40L и многие другие. FasL экспрессируется на активированных цитотоксических Т-лимфоцитах и естественных киллеров, а также на клетках кишечника, глаза, легких, почек, нервной ткани, плаценты. FasL по Fas, может существовать в связанной с мембраной и растворимой форме (sFasL и mFasL). Показано, что растворимый FasL имеет молекулярную массу 27 кД, существует в виде тройного, образующийся из мембранной формы в результате отщепления трансмембранного части определенной протеиназой. Растворимый форма FasL биологически активная, то есть способна индуцировать апоптоз в чувствительных клетках, экспрессирующих рецептор Fas. Реализация апоптоза. Главным «участником» процесса апоптоза является семье 14 цистеиновых протеиназ, которые расщепляют белки по пептидными связями после аспарагиновой кислоты и которые называют каспаза
Каспазы гомологичные между собой аминокислотными последовательностями и структурой. Они экспрессируются как проферменте и содержат следующие структурные элементы: N-концевой вариабельный домен, большую (20 кД) и малую (l0 кД) субъединицы. Активация каспаз происходит вследствие протеолитического расщепления связи между доменами и ассоциации большой и малой субъединиц с образованием гетеродимеру. Гетеродимеры, в свою очередь, ассоциируются и образуют тетрамер с двумя каталитическими центрами, работающими независимо.
Апоптичнои сигнал с поверхности клетки приводит активацию инициаторных каспаз, которые расщепляют и активируют эффекторные каспазы. Последние, в свою очередь, расщепляют внутриклеточные белки, что и приводит к развитию апоптоза. К инициаторных каспаз относят каспазы 8, 9, 10, а к эффекторных - 2, 3, 6, 7. Активация инициаторных каспаз требует связывания со специфическими кофакторами и адапторной молекулами.Наприклад, активация прокаспаз 8 и 10 происходит после их ассоциации с доменом DED (death effector domain) молекулы FADD (Fas-associated death domain). Прокаспаза 9 активируется через образование комплекса с адапторной молекулой APAF-1, цитохромом с и дАТФ. Эффекторные каспазы расщепляют различные внутриклеточные мишени: структурные белки, сигнальные белки, регуляторы транскрипции, белки, регулирующие метаболизм ДНК, гистоны и другие белки с
различными функциями. Среди гистонов чувствителен к действия эффекторных каспаз является гистона Н1. Расщепления этого гистона делает определенные участки ДНК доступными для действия эндонуклеаз. Каспаз также расщепляют ингибитор каспазоактивованои ДНКазы, что вызывает активацию этого фермента и расщепление ДНК на олигонуклеосомни фрагменты. Существует много путей индуцирования апоптоза, которые можно сгруппировать в три категории: от рецепторов, от митохондрий и от ядра. Первый путь активации апоптоза начинается после перекрестного связывания рецепторов ФНО-семьи (рецепторов «смерти») соответствующими лигандами. Такие рецепторы тримеризуються, вследствие чего на них появляются сайты связывания для адапторной белков семьи FADD (рис. 78).
С эффекторными доменами «смерти» DED молекулы F ADD напрямую ассоциируется прокаспаза 8. Олигомеризация прокаспаз 8 приводит к тому, что они расщепляют друг друга и таким образом самоактиву дерутся.
Каспаза 8 активирует другие каспазы - 3, 4, 6, 7 и 13. Каспаза 3, в свою очередь, активирует каспазы 6 и 9. Каспазы 3 и 6 принимают непосредственное участие в ядерном апоптозе. Предполагают, что каспаза 4 активирует митохондрии, что приводит к выходу из них в цитоплазму цитохрома с. Второй путь активации апоптоза связан с нарушением функций мембран митохондрий, в результате чего цитохром с может выходить в цитозоль и вместе с другими факторами активировать прокаспазы. Цитохром с связывается с адапторной молекулой APAF-1. При наличии дезоксиаденозинтрифосфату (дАТФ) происходит взаимодействие комплекса с каспазы 9 и активация последней. Ингибирование апоптоза на этом уровне может происходить при участии белка Все-Xl, который присоединяется к комплексу APAF-1 и каспазы 9 и блокирует его. Некоторые протеинкиназы, например протеинкиназа В (Akt), могут тормозить развитие апоптоза путем фосфорилирования определенных каспаз.
Выход цитохрома с с митохондnий контролируют некоторые белки семьи Все, встроенные в мембрану митохондрий (будут рассмотрены далее).
Третий путь активации апоптоза связан с экспрессией определенных проапоптичних генов. Главным транскрипционных факторов, определяющим экспрессию этих генов, является белок р53 - продукт гена р53 супрессора опухолей. Активация р53 пов2язана с различными метаболическими нарушениями в цитоплазме клетки, повышением уровня ионов Са +, появлением коротких фрагментов ДНК и т.д.. Активация р53 наблюдается также в случае нарушений клеточного цикла. Под действием р53 увеличивается экспрессия более 20 генов, в том числе белка Вах, рецептора Fas и др.. Итак, путь запуска апоптоза от ядра тесно связан с другими путями его индуцирования.
Кроме рассмотренных путей активации апоптоза существует еще путь непосредственной активации прокаспаз в цитозоле с помощью других протеолитических ферментов - гранзимив и гранулизину, которые доставляет в клетку-мишень активирован ЦТЛ или натуральный киллер. Этот путь подробно рассмотрен в разд. 11.
Противоречивые данные получены о том, что в некоторых типах клеток апоптоз может происходить без участия инициаторных или эффекторных каспаз. Такой тип гибели клеток называют каспазонезалежним (caspase independent form of cell death).
По способности проводить апоптичнои сигнал клетки можно разделить на два типа. Апоптоз в клетках первого типа происходит независимо от митохондрий и не блокируется гиперэкспрессией белка все-2. Апоптоз в клетках второго типа зависит от активации митохондрий. Гиперэкспрессия белков все-2 и Все-Xl в таких клетках полностью блокирует развитие апоптоза. Т-клетки относятся к клеткам первого типа, а В-лимфоциты - в клетки второго типа.