У всех млекопитающих в период эмбрионального развития СКК сначала образуются в стенке желточного мешка, затем мигрируют в печень, а затем заселяют костный мозг. В плоде человека в желточном мешке СКК формируются
на 3-й неделе, где находятся до 9-й недели (так называемая первая генерация СКК), на 5 - 6-й неделе заселяют печень, где находятся до конца эмбрионального развития (вторая генерация СКК) , а в костный мозг попадают на 10-11-й неделе (третья генерация СКК).
В костном мозге СКК размещаются у пристенной части кости в тесном контакте со специализированными стромальные клетки, которые создают необходимое для их развития микроокружения. Кроме самих СКК здесь находятся также их производные, так называемые нашвстовбурови клетки с более ограниченными возможностями - комитовани предшественники клеток миелоидного (эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов, мегакариоцитов) и лимфоидного (Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток) рядов.
Под влиянием клеточного микроокружения и локально продуцируемых цитокинов полустволовые и стволовые клетки привлекаются к пролиферации и дифференцировки. Процессы пролиферации и дифференцировки строго регулируются, что обеспечивает возможность самоподдержания относительно небольшой популяции СКК. Благодаря этой уникальной особенности - способности к самоподдержания - СКК обеспечивают постоянное пополнение потерь в кроветворной и лимфоидной ткани зрелых клеток с ограниченным жизненным циклом. Следует отметить, что свойства СКК были изучены задолго до идентификации их морфологии и фенотипа (см. разд. 1). Это стало возможным благодаря разработке соответствующих методических подходов к их исследованию.
Методы анализа СКК. Изучение функциональных характеристик СКК началось в 1961 p., Когда канадскими учеными Тело и Мак-Куллахом был предложен метод клонирования этих клеток в селезенке смертельно облученных мышей. После введения животным клеток костного мозга на строме (рис. 87) опустошенной облучением селезенки появляются в виде узлов колонии клеток (1-3 колонии на 10 введенных клеток), которые можно наблюдать визуально. Колонии в селезенке облученных животных можно получить также, если экранировать костный мозг во время облучения. Колонии, образующиеся при экранирование костного мозга животных, называют эндогенными, а те, что образуются после трансплантации костного мозга, - экзогенными.
Селезеночные колонии имеют клональное происхождения, было доказано с помощью индуцированных облучением хромосомных маркеров. Клетки, получивших высокую дозу (6,5 Гр) и выжили, как правило, несут индуцированные радиацией аберрации - хромосомные маркеры. По этим маркерами можно идентифицировать исходные клетки и их потомки во время кариологичного анализа. Во всех клеток одной колонии оказывается (если оказывается) одинаковый хромосомный маркер. Это свидетельствует о том, что каждая отдельная колония (состоит примерно из 10 незрелых клеток) образовалась в результате размножения одной исходной клетки, то есть клоном ее потомков. Эти исходные клетки, способные образовывать колонии в селезенке, называют селезеночным колониеутворювальнимы единицами (КУОС).
С точки зрения гистологии колонии в селезенке неоднородны и представлены тремя типами: эритроцитарных, гранулоцитарно-моноцитарного и мегакариоцитарную. После ретрансплантации клеток колонии любого типа новому облученном реципиенту снова образуются колонии всех трех типов с одним и тем же хромосомным маркером (и всегда с одинаковым соотношением: 42% эритроцитарных, по 21% гранулоцитарно-моноцитарных и мегакариоцитарную и 16% смешанных). Следовательно, клетки, образующие колонии, способные к самоподдержания (в колонии с одной КУОС образуются другие КУОС) и дифференцировки в более зрелые клеточные формы. При этом поддерживается линия КУОС, подтверждающий существование общего предшественника клеток миелоидного ряда.
Существование в костном мозге СКК, способных дифференцироваться в лимфоидном направлении, было показано в опытах на радиохимерах. Радиохимеры - животные, в организме которых функционируют клетки разных генотипов, их получают вследствие трансплантации аллогенного костного мозга реципиентам с подавленной облучением иммунной системой. После трансплантации облученным мышам линии СВА клеток костного мозга с кариологичною меткой (СВА/Т6Т6) вместе с лимфоцитами лимфатических узлов, не имели метки, потомки последних первыми заселяют лимфоидные органы, но постепенно вытесняются потомками клеток донора костного мозга. В последние годы существования в костном мозге КОЕ - предшественников лимфоцитов (как и КОЕ - предшественников клеток различных типов миелоидного ряда) и их способность к самоподдержания подтверждены in vitro во время культивирования клеток костного мозга в специальных полужидких средах (см. разд. 1). Для этого клетки костного мозга длительное время (5-10 недель) культивируют при наличии стромальных элементов костного мозга. Считают, что долго жить в такой культуре могут только клетки с высоким пролиферативным потенциалом. Затем такие клетки высевают в полутвердые среды с высоким содержанием цитокинов, необходимых для дифференцирования на определенные линии клеток. На таких средах СКК могут образовывать колонии как миелоидных, так и лимфоидных клеток в зависимости от наличия соответствующих цитокинов.
Для того чтобы идентифицировать фенотип СКК, предложили метод выборочного удаления из костного мозга гемопоэтических клеток, активно пролиферируют. Для этого к клеткам костного мозга добавляют
флуоресцентный аналог нуклеотидов - 5-флуоурацил, который накапливается в клетках, находящихся в клеточном цикле. Далее на клеточном сортировщик (цитофлуориметр) можно выделить эти клетки за флуоресценцией. Такая популяция клеток будет значительно обогащенная на СКК. Для их идентификации используют два критерия - способность к самовосстановлению in vitro и отсутствие поверхностных маркеров, характерных для всех известных гемопоэтических линий (CD3-, CD4-, CD8-, CD19-, CD20-, CD56-, CDllb ", CD14-, CD15- ). Такой фенотип сокращенно обозначают Lin (Jineage "). Для того чтобы получить Lin клетки, нужно отдельно удалить все другие субпопуляции клеток с помощью антител к их поверхностных маркеров. Сейчас СКК мышей идентифицируют по экспрессии рецептора c-Kit к фактору стволовых клеток-и избирательной экспрессией одного из маркеров Thy-1.1 или F № 2. Т.е. СКК мыши имеют фенотип Ьип c-Kit + Thy -1.1 + (F! k2 +).
Для анализа СКК человека используют трансплантацию костного мозга человека мышам с тяжелыми пороками развития лейкоцитарных клеток, которые получают скрещиванием мышей линий NOD и SCID. Эта экспериментальная модель не является полностью адекватной, поэтому большинство опытов по СКК человека проводят в культуре in vitro.
Показано, что почти все СКК человека экспрессируют сиаломуцинов CD34, который проявляется также на клетках эндотелия, где он лигандом для L-селектина. Считают, что CD34 может вызывать взаимодействие СКК с стромальных элементов костного мозга. На СКК человека отсутствует экспрессия маркера CD38. Итак, вероятнее всего, СКК человека имеют фенотип Lin CD34 + CD38. Миграция СКК. Важной особенностью СКК является их способность выходить из костного мозга в кровь, циркулировать в кровяном русле и колонизировать другие отделы кроветворной и лимфоидной систем (прежде тимус) и даже нелимфоидни периферические ткани.
Миграция СКК начинается еще во время эмбриогенеза. Как уже отмечалось, СКК появляются сначала в желточном мешке примерно через 7,5 суток развития эмбриона мыши. Эти клетки дают начало первым эритроидных клеток и, вероятно, клеткам сосудов - эндотелиоцитов. Поэтому их еще называют гемангиобластамы. Они не обладают способностью защищать смертельно облученных взрослых животных, очевидно, из-за отсутствия у них хемокиновых рецепторов и способности заселять костный мозг. Через 9 - И0 суток развития в эмбриональной печени появляются СКК, которые, вероятно, попадают сюда из желточного мешка. Эти клетки уже приобретают способность защищать облученных реципиентов и мигрировать в костный мозг. Аналогичные свойства приобретают через 10 суток развития СКК желточного мешка. На 12-е сутки печень приобретает максимальную гемопоэтической активности. СКК печени Мас-1 + отличаются от СКК костного мозга по профилю клеток, на которые они могут дифференцироваться. Так, только в эмбриональной печени образуются В-кл + заборы субпопуляции В-1 (CD5 +) и Vy3 и Vy4 Т-клетки. Кроме того, из печени выходят CD3 CD4, экспрессирующих интегрин а4! 7. Считают, что такие клетки являются напивстовбуровимы клетками, которые дают начало антигенпрезентувальним ДК (таким как клетки Лангерганса), НК-клеткам и, возможно, ФДК. На 16 - 17-е сутки развития СКК из печени начинают заселять костный мозг. Итак, благодаря миграции эмбриональных СКК обеспечивается поэтапное заселение различных гемопоэтических органов.
Определенная часть СКК постоянно циркулирует по 3кровью и у взрослых мышей. Этот показатель у мышей составляет 0,3% общего количества (3,3 • 10) СКК в организме. Концентрация СКК в крови эмбрионов превышает в несколько раз их содержимое у взрослых, а максимальный уровень регистрируется в поздний пренатальный и ранний постнатальный период. В процессе старения мышей интенсивность миграции СКК снижается.
В крови человека также наблюдается высокая концентрация СКК в пренатальный период, поэтому клетки пуповинной крови можно использовать как гемопоэтические клетки вместо костного мозга при трансплантациях. Очевидно, в перспективе будут проводить криоконсервации пуповинной крови каждого родившегося ребенка, что позволит (в случае необходимости) проводить аутотрансплантацию собственной гемопоэтических активной ткани.
Эндотелиальные клетки костного мозга всегда экспрессируют молекулы адгезии VCAM-1, интегрин VLA-4, L-селектин т.д., что приводит хоминг («возвращение домой») СКК, мигрирующих. Кроме того, СКК экспрессируют хемокиновых рецептор CXCR4 и селективно отвечают на лиганд SDF-la который экспрессируется эндотелиоцитами костной ного мозга.
Убедительные доказательства способности СКК ди миграции были получены (Р. В. Петров PM Хаитов) в экспериментах на соединенных парабиозе (целиарний анастомоз) сингенних мышах (линии СВА / Н), которые отличались по хромосомным маркером Т6Т6 один из партнеров по парабиоза к операции облучали тотально, а в другом (с маркером) экранировала задние конечности. В селезенке тотально облученного парабионта все эндогенные КУОС несли хромосомный маркер, что свидетельствует о миграции их из экранированного костного мозга. Авторы установили, что миграция и рециркуляция СКК на уровне организма контролируется эндогенными глюкокортикоидами (гормонами надпочечников). Считают, что физиологические концентрации этих гормонов достоверно вызывают сдерживающее воздействие на миграцию СКК, а повышение их уровня, например вследствие интенсивного действия различных стрессовых факторов, сопровождается уменьшением количества СКК в циркуляции.
Миграция и рециркуляция СКК является важным этапом иммуногенеза. Иммунизация антигенами и вакцинами значительно интенсифицирует эти процессы. После введения полицукридних антигенов количество СКК, рециркулируемого, увеличивается в десятки раз. Процессы воспаления и различные цитокины и значительные потери крови стимулируют миграцию и рециркуляцию СКК.
Физиологическая роль миграции СКК, кроме миграции в тимус, остается неизвестной. Одним из возможных объяснений миграции является потребность в перераспределении гемопоэтической ткани между ячейками костного мозга. Благодаря миграции СКК могут попадать в различные ячейки, поддерживает баланс кроветворной ткани в различных участках костного мозга. Предполагают, что СКК могут попадать в различные органы нелимфоиднои природы и дифференцироваться в клетки этих органов. Так, in vitro показана возможность дифференцировки СКК на нервные клетки, гепатоциты, сердечные и скелетные мышцы и т.д.. Такое дифференцировки СКК называют трансдиференииюванням. Имеет ли место физиологическое трансдиференциювання in vivo. пока остается предметом дискуссий, но, как предполагают, такое дифференцировки может происходить в случае травм или поражения периферических тканей. Возможно, именно с этим связан повышенный уровень рециркуляции СКК во время воспаления. Известно, что во время воспаления увеличивается выход из костного мозга в кровь нейтрофилов, которые частично расщепляют внеклеточный матрикс на сосудах, оставляя «дыры» для выхода других клеток. Показано, что ингибиторы эластазы нейтрофилов блокируют повышение уровня рециркуляции СКК во время воспаления. Сейчас интенсивно изучается возможность использования СКК для восстановления поврежденных тканей при различных патологических состояний, в частности при инфаркте миокарда.
Итак, благодаря миграции и рециркуляции СКК и заселению ними лимфоидных органов, прежде тимуса, где осуществляется их дифференцировки, в организме поддерживается гомеостаз гемопоэтической системы.
Загрузка...