Преодоления тканевой несовместимости под чнс пересадки органов и тканей в клинике достигается подбором донорно угнетением иммунных реакций реципиента. 17.3.1. Подбор донора.
Для трансплантации осуществляют подбор донорно, наиболее совместного зн антигенным набором с реципиентом. Во чнс подбора ПНР донор - реципиент учитывают тнки показатели: совместимость зн антигенами систем AB0, Rh тн HLA, наличие у реципиента преформированных антител к антигенам донорно. Подбор донорно, совместного зн антигенами системы АВ0, мне особенно большое значение для трансплантации почки.
Основной метод подбора донорно - определение антигенов системы HLA in vitro (HLA-типирование). Как уже отмечалось в разд. 5, система HLA контролируется тремя локусами генов (HLA-A, HLA-B, HLA-C), кодирующих антигены HLA класса I, тн тремя локусами генов (HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP), кодирующих антигены HLA класса II. Определение антигенов HLA донорных и реципиента дне возможность
установить степень их HLA-совместимости, следовательно, п. .. Оценить степень HLA-совместимости донорных и реципиента моя реакции между их лимфоцитами (реакция в смешанной культа серологического определения антигенов. Антигены HLA диагностических анти-НLА-сывороток серологическими метода клеточными тестами, в частности РЗКЛ. Смешанная культура лимфоцитов. Реакция смешанных лимфоцитов широко используется для выявления алоантигенив лимфоцитов. Смесь лимфоцитов донорных и реципиента культивируют in vitro в течение нескольких (от 3 до 5) суток. Если лимфоциты донорно содержат Т-клетки, специфичные к алоантигенив, экспрессированных нн клетках реципиента, то они будут активироваться и размножаться. Аналогично Т-клетки реципиента реагировать нн алоантигены нн клетках донорно. Описанный вариант реакции зн двустороннего гистонесумисности донорных и реципиента называют двостямованою реакцией в ЗКЛ.
Чаще используют однонаправленную реакцию в ЗКЛ, в которую клетки одной особи вводят интактными, их называют реагирующими, н клетки другой особи подавляют ионизирующего излучением НБО митомицином С. Обработанные таким способом клетки теряют способность синтезировать ДНК и размножаться, сохраняя способность стимулировать другие клетки, их называют стимулирующим . В рнзи трансплантации солидных ткннин в ЗКЛ подавляются клетки донорно, следовательно, проверяется реактивность только клеток реципиента против алоантигенив донорно. При трансплантации костного мозга реципиенту с подавленной иммунной системой митогенного ингибитором обрабатывают клетки реципиента и таким образом проверяют реактивность только клеток донорно.
Зн помощью ЗКЛ можнн не только выявлять алоантигены, н и определять их, инкубируя тест-клетки с гомозиготными стимулирующих клетками (лимфоцитами) известной HLA II-специфичности, которые несут известные антигены HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR от гомозиготных зн ними доноров. Если тест-клетки не реагируют бласттрансформации и пролиферацией нн стимулирующие клетки определенного типа, то это свидетельствует о том, что они несут антиген этой специфичности. Итак, ЗКЛ дне оценить совместимость донорных и реципиента без анализа антигенов HLA тн выявить различия зн антигенами HLA-DQ, и особенно HLA-DP, которые не проявляют серологическими методами в связи со сложностью получения диагностических сывороток им.
Реакция в ЗКЛ трактуется как ответ in vitro Т-лимфоцитов нн алоантигены HLA. В ЗКЛ CD4 Т-клетки стимулируются антигенами HLA класса II нн МА3 <рофагах, В-лимфоцитах, ДК и развивают пролиферативную ответ, который оценивают зн включением Н-тимидина. Реакция ЗКЛ сопровождается также активацией CD8 Т-клеток антигенами HLA класса I, которые дифференцируются нн ЦТЛ, способные убивать клетки-мишени. Киллерных эффект Т-клеток можнн протестовать в пробе лимфоцитотоксичности in vitro с мечеными Cr лимфоцитами-мишенями. Цитотоксический эффект генерированных в ЗКЛ Т-киллеров определяют зн высвобождением Cr из клеток-мишеней. ЗКЛ является индикатором степени гистосовместимости донорных и реципиента. Чем сильнее выражена реакция в ЗКЛ, тем больше несоответствие между донором и реципиентом зн антигенами HLA, прежде класса II, которая является важнейшим фактором отторжения трансплантата. Однако этот метод дне результаты только через несколько суток и может использоваться только зн условия плановых операций. Реакция в ЗКЛ - основной метод подбора донорно для трансплантации костного мозга и лимфоидной ткани. При пересадке органов (особенно от лиц, погибших) проводят тканевое типирование - серологическое определение антигенов HLA зн помощью антисывороток.
Серологическое определение антигенивHLA. Этот метод типирования состоит в серологическом определении фенотипа HLA донорных и реципиента тн установлении степени их гистосовместимости. Фенотип определяют, типуючы лимфоциты периферической крови, нн которых плотно экспрессированных антигены HLA, зн помощью набора диагностических aнты-HLA-сировнток, содержащие антитела ко всем известным антигенов системы HLA, НБО моноклональных антител МКАТ. Большой набор диагностических реагентов необходим в связи со значительным количеством изоантигены в этой системе. Идентифицировано около 80 различных молекул класса I (HLA-A, HLA-B, HLA-C) и около 40 молекул класса II (HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR). В Украину типирования чаще всего проводят зн антигенами локусов HLA-A, В, С и DR. Антигены гистосовместимости обычно определяют зн помощью цитотоксического теста, основой которого является способность сыворотки (антител), специфической к определенного антигена HLA, явления зн наличии комплемента лизис лимфоцитов, имеющих этот антиген. Гибель клеток регистрируют зн окрашиванием их приветственными красителями, чаще всего - трипановым синим (см. разд. 5). Для определения антигенов класса I используют неразделенной суспензию лимфоцитов, н для определения антигенов класса II - суспензию, обогащенную В-лимфоцитами, нн поверхности которых эти антигены. Лимфоциты донорных и реципиента лизируются набором (группой) тех сывороток, которые являются специфичными к экспрессированных нн их поверхности антигенов. Зн результатам реакции с различными сыворотками (антителами) устанавливают серологический тип каждого антигена HLA нн клетках.
Следует отметить, что в связи со сложностью получения диагностических сывороток (для серологического типирования) до редких антигенов HLA II (особенно HLA-DP) и длительным течением реакции в ЗКЛ последнее время проводят типирование генов HLA класса II, используя молекулярно-генетический метод - полимеразную цепную реакцию, принципы которой описано в разд. 21.
Лимфоцитотоксичний тест используется также для определения у реципиента преформированных антител к антигенам HLA донорно. Эту реакцию с лимфоцитами донорных и сывороткой реципиента называют перекрестной пробы на индивидуальную совместимость, НБО кросс-матч (cross-match). Наличие преформированных антител является фактором риска сверхострой отторжения трансплантата. Однако известны случаи сверхострой отторжения трансплантата зн отрицательной перекрестной пробы, одной из причин которого может быть пресенсибилизация реципиента к другим (не HLA) антигенов, особенно к тем, что экспрессируются нн клетках эндотелия.
Заметим, что цитотоксической активностью характеризуются антитела против антигенов HLA класса I, которые экспрессируются нн всех клетках организма и трансплантата. Высокие титры этих антител обусловливают разрушение трансплантата зн механизмом комплементзалежного лизиса. Эти антитела определяют в цитотоксические тесте с Т-лимфоцитами зн температуре 37 ° С и их называют теплоеимы анти-Т-антителами .. Антитела против антигенов HLA класса II обусловливают не цитотоксический, н блокирующий эффект: экранирующих антигены HLA (в частности, DR-антигены) нн АПК и предотвращают иммунном распознаванию, способствуя таким образом выживанию трансплантата. Эти антитела определяют в цитотоксические тесте с В-лимфоцитами зн температуре 8-10 ° С и называют холодовыми анти-В-антителами.
Наличие в сыворотке крови реципиента преформированных цитотоксических анти-HLA-антител против антигенов HLA донорно является противопоказанием для использования органа этого донорно для трансплантации. Зн отсутствии цитотоксических антител вывод о возможности трансплантации делают с учетом степени совместимости донорных и реципиента. Оптимальным вариантом является совместимость донорных и реципиента зн антигенами системы AB0, Rh тн HLA. Однако практически невозможно подобрать полностью совместимых донорных и реципиента, поэтому селекция, по сути, сводится к подбору приемлемого донорно. Вероятность быть полностью HLA-совместимого донорно наибольшая среди родственников и составляет 1:4 среди родных братьев и сестер (сибсив). Подбор оптимального соотношения между донором и реципиентом значительно продлевает продолжительность выживания трансплантата. Наилучшие результаты получают в рнзи совместимости донорных и реципиента зн антигенами HLA класса II, особенно зн антигенами HLA-DR. Среди антигенов HLA класса I наибольшее значение имеют те, которые кодируются локусом В. Клинические наблюдения позволили установить, что последствия типирование HLA влияют нн продолжительность жизни трансплантата зависимости от предварительно проведенных реципиенту трансплантаций, гемотрансфузий.
Поскольку в клинике допускают пересадки и зн несовместимости зн одним-двумя антигенами системы HLA, то подбор донорно во многих случаях полностью не исключает развития реакции (кризис) отторжение. Кризиса отторжения могут повторяться и сопровождаются разрушением части паренхимы трансплантата (органа), что приводит к постепенному угасанию его функций. Вместе лимфоцитов. Однако применение ПкАТ повышает риск инфекций у реципиента. Возможны и другие осложнения, связанные с наличием в препаратах чужеродного белка (аллергические реакции) и антител различной специфичности (тромбоцитопения). Кроме того, эти препараты глобулинов разрушают Т-лимфоциты независимо от их антигенной специфичности, то есть не только те, которые реагируют против трансплантата. Эффективным является применение «гуманизированные» мышиных МКАТ (см. разд. 22) с определенной направленной действием, поскольку позволяет минимизировать антигенность этих белков для человека. МКАТ специфичные для определенных поверхностных молекул клеток, участвующих в процессах распознавания антигена и активации лимфоцитов. Некоторые из МКАТ могут вызвать деструкцию лимфоцитов, другие - блокировка функции своих белков-мишеней, не разрушая клеток, которые экспрессируют. В клинической трансплантации используют МКАТ мыши против СБ3-молекулы человека (муромонаб-СО3), являющейся частью Т-клеточного антигенрозпизнавального комплекса. В эксперименте для предотвращения отторжения трансплантата используют МКАТ против различных молекул клеточной поверхности Т-лимфоцитов: CD4 - маркера главной, как полагают, в реакции отторжения субпопуляции Т-клеток; CD8 - маркера цитотоксических Т-лимфоцитов, CD25 (а-цепи рецептора ИЛ-2 ) - ответственного за восприятие сигнала от цитокина; ИСАМ-1 (CD54) - важной для адгезии (и активации) и CD154 (ОТ40-лиганд), важной для активации Т-клеток. Исследуются также МКАТ к экспрессированных на АПК костимуляторних молекул В7.1 (CD80) и В7.2 (CD86), взаимодействие которых с их лигандом CD28 на Т-клетках запускает каскад необходимых для активации сигналов. Другой подход заключается в использовании альтернативного CD28 лиганда костимуляторних молекул - CTLA-4, связывание которого с молекулами В7 приостанавливает активацию Т-клеток. Показано, что введение растворимого CTLA-4 (или CTLA4-Ig) животным способствует длительному выживанию некоторых трансплантированных тканей. Эффект CTLA-4 обусловлено блокированием костимуляции Т-клеток, специфичных к антигенам гистосовместимости донора, и индуцированием у них состояния анергии. Итак, антитела, в отличие от широко применяемых лекарственных средств, способных вызывать нежелательные эффекты на нелимфоидни ткани, действуют направлено на определенные клетки иммунной системы. К тому же эффективность антител можно повысить, коньюгуючы их с токсинами. Еще один новый подход заключается в конъюгации с токсинами цитокинов. Например, конъюгаты ИЛ-2 - токсин, связываясь с ИЛ-2-рецепторами, обусловливают инактивацию клеток, несущих эти рецепторы. Однако, несмотря на всю привлекательность, терапия криза отторжения с помощью биологических агентов, антител и цитокинов находится еще на стадии поиска. Кроме того, биологические агенты, хотя и действуют более избирательно, в чем их преимущество над лекарственными средствами, также характеризуются неспецифическими иммуносупрессивными свойствами. В перспективе описаны новые подходы будут совершенствоваться так, чтобы можно было избирательно элиминировать или блокировать активность тех клонов лимфоцитов, специфичные к антигенам трансплантата, не влияя на все остальные клоны. Это позволит избегать нежелательных побочных эффектов, в том числе снижение резистентности к инфекциям.