Еще в 30-х годах было показано, что молекула белка может связать несколько молекул антител одновременно.
В 50-х годах стало ясно, что антитела взаимодействуют с дискретнимы участками на поверхности белковой молекулы. Их назвали антигенными детерминантами. Были сформулированы проблему: что составляет антигенную детерминанту? Какие свойства позволяют той или иной области белка быть распознан как чужеродные и вызвать иммунный ответ?
Сначала, как модель, были использованы короткие синтетические пептиды. Оказалось, что линейные гомополимеры аминокислот (типа (Ala-Ala) n) неимуногенни, но после конъюгации с белком-носителем ведут себя как гаптены, т.е. имеют антигенную специфичность. Розгилковани гетерополимеры аминокислот высокоиммуногенной и вызывают синтез антител к поверхностным участков молекулы. Пептиды, взятые в упорядоченной или денатурированный форме, имели различную антигенную специфичность. Если синтетический антиген нос заряженные группы, то антитела к нему имели противоположный заряд.
Было сделано выводов, что антигенные детерминанты находятся на поверхности молекулы, имеющие определенную конформацию и несут аминокислотные остатки, способные образовывать Нековалентные связи с антителом.
Главные работы по антигенной структуре глобулярных белков было проведено в 70-80-е годы ХХ века. В результате их было выяснено, что антигенная детерминанта эпитоп - это обособленная область на поверхности белковой молекулы. В состав ее входят 6-7 аминокислотных остатков. Не было найдено связи с каким-то определенными аминокислотными остатками: в состав антигенных детерминант входили те аминокислоты, которые обычно расположены на поверхности белка. Оказалось, что каждая антигенная детерминанта описывает на поверхности белка линию длиной 23-25? и имеет детерминированы N и C конце.
Различают последовательные (линейные) и прерывистые (конформационные) антигенные детерминанты.
Последовательные - определяются порядком аминокислот. Антитела к таким эпитопов легко взаимодействуют с линейным пептидом такой же последовательности. В чистом виде встречаются в фибриллярных белков и пептидов. В глобулярных белков поверхностные последовательные участки имеют определенную конформацию. Антитела, полученные до пептидов, часто узнают нативные белки, т.е. могут определенным образом приспосабливаться к конформации поверхностных фрагментов.
Прерывистые антигенные детерминанты состоят из аминокислотных остатков, расположенных далеко друг от друга в полипептидной цепи, но сближенных за счет третичной структуры белка, прежде всего дисульфидных связей. Такие антигенные детерминанты нельзя смоделировать линейным пептидом.
Не все аминокислоты, входящие в состав эпитопов, имеют одинаковое значение для распознавания: как правило, специфичность определяется 1-2 остатками (имунодоминантнимы), а другие играют роль в поддержании должного конформации эпитопов.
Как примеры, рассмотрим антигенную структура миоглобина кашалота и лизоцима куриного яйца - первых детально изученных белковых антигенов.
Миоглобин - гемовмисний белок мышц с молекулярной массой 18 кДа, состоящий из 153 аминокислотных остатков, не содержит дисульфидных связей. В молекуле миоглобина были определены пять линейных эпитопов: фрагменты 16-21, 56-62, 94-99, 113-119 и 146-151. В их состав входили гидрофильные полярные аминокислоты.: Lys, Arg, Glu, His.
Лизоцим - фермент, содержащийся в секреторных жидкостях организма млекопитающих и в белке птичьих яиц, с молекулярной массой 14 кДа, имеет четыре дисульфидные связи. В составе лизоцима были определены три прерывистые антигенные детерминанты, которые соответствовали фрагментам:
22-34 и 113-116, сближенных дисульфидных связей 30-115;
62-68 и 74-96, сближенных связями 76-94 и 64-80;
6-13 и 126-129, сближенных связи 6-127.
Для изучения этих антигенных детерминант было предложено специальный экспериментальный подход - синтез, имитирующий поверхность. Так, для имитации прерывистого эпитопы остатки был идентифицирован как имунодоминантни, сшивали в единое пептид, сочетая отдельные фрагменты с помощью глициновыми спейсора:
116 113 114 34 33
Lys Asn Arg Phe Lys
Lys-Asn-Arg-Gly-Phe-Lys
Такой пептид эффективно блокировал связывание специфических антител с белком, т.е. был похож на естественный прерывистый эпитоп.
В 80-е годы стало ясно, что вся поверхность белка может быть антигенной, т.е. если для иммунизации использовать синтетические пептиды, то можно получить антитела к любой поверхностью участка. Однако при иммунизации целым белком антитела образовывались только к определенным участкам. Использование моноклональных антител четко определенной специфичности показало, что каждый антигенная детерминанта фактически состоит из нескольких потенциально антигенных участков перекрываются. Теперь такие эпитопы стали называть более удачным термином имунодоминантни области.
Естественно, встал вопрос, какие факторы определяют имунодоминантнисть.
Исходя из признанной функции иммунной системы отличать "свое" от "чужого", первым принципом, положенным в основу имунодоминантности, был принцип чужеродности антигена по отношению к белкам реципиента. Чтобы выяснить справедливость этого принципа изучали серии гомологичных белков, т.е. белков, которые встречаются во многих организмов и отличаются отдельными аминокислотными заменами. Идеальными для таких экспериментов оказались цитохромы с.
Цитохромы с - это гемовмисни белки дыхательной цепи митохондрий с молекулярной массой 13 кДа, состоящие из около 100 аминокислотных остатков. Они появились очень рано в эволюции живого мира, первые цитохромы с встречаются у бактерий. Структура белка оказалась настолько удачной, что сохранилась в принципе к высших животных. Цитохромы млекопитающих отличаются между собой отдельными аминокислотными остатками, т.е. могут быть рассмотрены как точечные мутанты. Было обнаружено прямой связи между иммуногенностью цитохрома с и количеством остатков, которые отличали антиген от гомологического цитохрома с реципиента. Но относительно специфичности антител, которые производились, эта связь не оказался абсолютным. Так, кролики, иммунизированных собственным цитохромом, модифицированным глютаровый альдегид,
14
вырабатывали антитела против эпитопов собственного цитохрома. Когда животных разных видов иммунизировали одним типом цитохрома, то антитела вырабатывались против одних и тех же участков. Тогда стали рассматривать другой принцип имунодоминантности - связь со структурными особенностями антигена: доступностью, зарядом, специфическим расположением на сгибе подипептидного цепи. Было предложено алгоритмы поиска имунодоминантних участков по принципам гидрофильности и атомной подвижности. Дальнейшие эксперименты выявили связь гидрофильности и подвижности с эволюционной вариабильнисть: аминокислотные замены, которые закрепились в эволюции, не должны нарушать биологические функции цитохрома с и поэтому локализовались у поверхностных, наиболее гибких участках, где появление другой аминокислоты наиболее безопасна и может быть компенсирована за счет гибкости молекулы.
В результате этих исследований было дийдено выводу, что хотя вся поверхность белка в принципе может быть антигенной, при естественной иммунизации нативным белком антитела образуются только к определенным эпитопов, имунодоминантнисть которых определяется их структурными особенностями, прежде всего, гидрофильностью и атомной подвижности (гибкости).
Антитела (и В лимфоциты) связывают нативный антиген и узнают на его поверхности так называемые В-эпитопы. Но в процессе иммунного ответа антиген узнаваем и Т лимфоцитами. Более того, именно специфичность Т лимфоцитов определяет те имунодоминантни участка будет опознан как В-эпитопы. Участки антигена, которые распознаются Т лимфоцитами, называются Т-эпитопами. Их положение и структура определяются не так легко, как для В эпитопов, потому что Т клетки узнают антигены совсем по-другому.
1. Для распознавания Т лимфоцитами антиген должен быть процесованим (расщепленным). Процессинг происходит внутри специализированных клеток под действием протеолитических ферментов. Спектр пептидов, образующихся зависит от типа протеаз, которые отличаются у разных типов клеток.
2. Процесований пептид должен быть представленным в комплексе с белками главного комплекса гистосовместимости: отбор антигенного пептида зависит от структуры этих белков, которые являются высоко полиморфными и отличаются даже в разных личностей одного вида.
3. Распознавание представленного пептида зависит от репертуара Т-клеточных рецепторов, который является результатом положительного и отрицательного отбора в определенного индивида.
В результате, Т-эпитоп - это не обязательно поверхностная структура; не конформационно-зависимый, а линейный пептид. Его положение не связано с гидрофильностью или подвижностью полипептидной цепи. Оно зависит как от структуры нативного белка (потенциальные сайты протеолиза, пептидные мотивы, соответствующие сайтам связывания белков гистосовместимости), так и от состояния иммунной системы индивидуального реципиента (репертуар белков гистосовместимости и Т-клеточных рецепторов). Т-эпитопы больше связаны с сайтами чужеродности антигена по отношению к белкам реципиента, чем В-эпитопы, поскольку репертуар Т-рецепторов проходит более строгий отрицательный отбор.
Определение строения и локализации В и Т эпитопов представляет не только фундаментальный интерес. Оно необходимо для создания эффективных вакцин и имунодиагностикумив.
Иммунная система способна узнать почти любое вещество из среды, окружающей макроорганизм. Для этого антиген должен быть надлежащим образом представлен иммунным клеткам. В лимфоциты и антитела узнают конформационно-зависимые поверхностные эпитопы, расположенные в местах наибольшей гидрофильности и гибкости полипептидной цепи. Т лимфоциты узнают внутренние линейные пептидные фрагменты, которые образуются в результате протеолиза (процессинга) нативного антигена.