Сывороточные антитела представляют собой гетерогенную смесь иммуноглобулинов различных классов и специфичности.
Мечтой иммунологов с давних времен было получить гомогенные антитела, чтобы изучать их свойства, кристаллизовать для рентген-структурного анализа и использовать в практических целях. Частично эту функцию выполнили миеломные антитела, которые являются естественными моноклональными антителами, т.е. происходят из потомков одной В клетки, которая была злокачественно трансформирована. Между прочим, злокачественные новообразования в иммунной системе - это почти исключительно В-клеточные заболевания. Считают, что это является следствием соматического гипермутагенезу, который с большой вероятностью дает трансформированные клетки.
Таким образом, лимфопролиферативные заболевания - это плата за высокую специфичность иммунного ответа. Миеломные антитела успешно использован для многих экспериментов, но мечта получить моноклональные антитела желаемой специфичности оставалась. Сначала пытались выделить их из сывороточной смеси путем разделения популяций по заряду, гидрофобности, другим физико-химическим свойствам, но это было не очень эффективно.
В начале 70-х годов были уже хорошо разработаны методы культивирования иммунных клеток in vitro. Биохимики изучали в них, в частности, ферменты биосинтеза пуринов и пиримидинов. Было обнаружено, что нормальные клетки используют два пути биосинтеза Пурини: de novo и повторное использование продуктов их расщепления. Синтез de novo проходит с помощью фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансферазы (ГФРТ). Было найдено опухолевые линии клеток, дефектные по этому ферменту, т.е. такие, которые не могли синтезировать нуклеотиды de novo. Если такие клетки культивировать в присутствии Аминоптерин (блокирующий повторный путь использования метаболитов нуклеотидов), они погибают. Нормальные клетки в таких условиях выживают, так как могут синтезировать нуклеотиды de novo. Параллельно широко изучали методы гибридизации клеток - слияние их мембран с помощью электрического импульса или химического воздействия полиэтиленгликоля. Именно на основе этих экспериментов у Дж. Келера возникла идея гибридизировать нормальный В лимфоцит, который продуцирует антитела, с клетками миеломы, дефектной по ГФРТ. Если такие клетки культивировать в присутствии Аминоптерин, опухолевые клетки погибнут, поскольку не могут синтезировать пурины de novo, нормальные лимфоциты погибнут, поскольку не могут существовать в культуре без дополнительных ростовых факторов, и в живых останутся только гибриды, что осталось от миеломных клеток бессмертие, а от нормальных клеток - путь синтеза нуклеотидов de novo. Если теперь найти среди них клетки, продуцирующие антитела нужной специфичности, то можно получить их клон и, соответственно, гомогенные моноклональные антитела. Ц. Мильштайн, в лаборатории которого работал Келер, был против таких экспериментов, поскольку считал, что вероятность нахождения антиген-специфических клонов в такой смеси очень низкая. Но Келер поставил этот эксперимент на свой страх и риск и нашел довольно много положительных клонов. Теперь мы знаем, что вероятность их нахождения достаточно высока: при сильном иммунном ответе каждый 20-й из образованных клонов может быть положительным. Эксперимент Келера был революционным: сбылась мечта поколений иммунологов, - и заслуженно был награжден Нобелевской премией. Теперь это достаточно рутинная методика. Клетки, которые образуются в результате гибридизации называют гибридомы, а процесс их получения - гибридомной технологии. Надо отметить, что разработка этой технологии стала возможной только благодаря определенному уровню развития биохимии, методов культивирования клеток in vitro и иммунологических методов, которые позволили анализировать специфичность антител большого количества образованных клонов.
Гены иммуноглобулины уникальны тем, что функциональный ген одной полипептидной цепи состоит из нескольких генных фрагментов, которые сближаются и объединяются в процессе развития лимфоцитов. За счет наличия множества вариантов V-генов, комбинаций VJ и VDJ, а также тяжелых и легких цепей, и некоторых дополнительных механизмов ограниченный репертуар генов дает практически неограниченный репертуар специфичности антител, еще повышается за счет соматических мутаций. Иммуноглобулины могут существовать как в мембранной, так и в растворимой форме, что достигается за счет использования при транскрипции их генов альтернативных стоп-кодонов. Переключение классов иммуноглобулинов происходит путем или альтернативного сплайсинга РНК, или необратимо делеции промежуточной ДНК. При биосинтезе антител выход из эндоплазматического ретикулюму происходит только после окончательной сборки всех полипептидных цепей.
Загрузка...