Окраска по Цилю-Нильсену используется в бактериологии для выявления эндоспор и для индикации микобактерий. В осуществлении этого метода также можно выделить четыре этапа.
А. На первом этапе на фиксированный мазок помещается фильтровальная бумага, на которую наливается фуксин Циля. Фуксин Циля отличается от водного фуксина («фуксина Пфейффера») более высокой концентрацией и наличием карболовой кислоты, вследствие чего для его обозначения используется также термин «карболовый фуксин». После чего предметное стекло с мазком нагревается над пламенем горелки.
1. Окрашивание продолжается примерно 5 минут, но, как правило, продолжительность этого этапа определяется «отхождением трех паров»: стекло держат над пламенем до появления парения, после чего отводят в сторону и ждут прекращения парения – и так три раза.
2. Мазок на этом этапе окрашивается в красный цвет. Обычными методами споры и микобактерии окрасить нельзя – вследствие особенностей своего химического состава они не воспринимают анилиновые красители при обычном режиме окраски. Чтобы их окрасить, необходимо использование сочетанного действие трех факторов: повышенной концентрации краски, обработка кислотой и повышенная температура (так называемое «термокислотное протравливание»).
Б. На втором этапе мазок обязательно нужно выдержать некоторое время на воздухе для охлаждения, иначе стекло на следующем этапе может лопнуть.
В. На третьем этапе мазок обесцвечивается кислотой. Обычно используется серная кислота – 1% для окраски спор и 5% для окраски микобактерий.
1. Обесцвечивание продолжается от 2 до 5 секунд с последующим обильным промыванием водой.
2. Споры и клетки микобактерий не обесцвечиваются (свойство кислотоустойчивости) и остаются красными. Все остальное – обесцвечивается.
Г. На четвертом этапе мазок окрашивается метиленовой синькой.
1. Окраска продолжается 3 – 5 минут. При этом лучше этот этап продлить подольше по той же причи-не, что и последний этап окраски по Граму. Споры и микобактерии эту краску не воспримут и останутся красными, а вегетативная часть клетки и все бактерии, за исключением микобактерий окрасятся в синий цвет.