В ряде случаев, например, с научными, санитарно-гигиеническими целями или для постановки реакции нарастания титра фага необходимо выделить фаг или из объекта окружающей среды или из бактериальной культуры
, а иногда еще и определить его количество в единице объема (этот показатель и определяется термином титр бактериофага).
А. Выделение бактериофага проводят по следующему алгоритму.
1. Материал, их которого выделяется бактериофаг (объект внешней среды или бактериальная культура), фильтруют через бактериальный фильтр.
2. Фильтрат помещают в жидкую питательную среду, куда засевают чувствительную к выделяемому фагу бактериальную культуру.
3. После термостатирования проводят учет опыта.
а. Рост бактерии свидетельствует об отсутствии в исследуемом материале искомого бактериофага.
б. Отсутствие роста бактерий свидетельствует, что искомый бактериофаг в исследуемом материале присутствует.
Б. Титрование бактериофага проводят или по методу Аппельмана или по методу Грациа.
1. Титрованием фага по Аппельману можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до порядка. Для этого используется жидкая питательная среда.
а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в жидкой питательной среде.
б. Каждое разведение засевается чувствительной к данному фагу бактериальной культурой.
в. Посевы инкубируются в термостате.
г. Последнее разведение фагосодержащего материала, в котором не будет роста – это и есть титр бактериофага.
2. Титрованием фага по Грациа можно определить концентрацию бактериофага в единице объема с точностью до одной фаговой корпускулы.
а. Фагосодержащий материал десятикратно разводится («титруется») в полужидкой питательной среде.
б. К каждому разведению добавляется чувствительная культура с таким расчетом, чтобы в отсутствие бактериофага получился рост в виде газона.
в. Каждое разведение фагосодержащего материала в полужидкой среде с добавлением чувствительной культуры заливается в чашку Петри на слой плотной питательной среды, используемой в роли под-ложки.
г. Посевы инкубируются в термостате.
д. Низкие разведения бактериофага полностью лизируют бактерии и роста не наблюдается. По мере разведения фага появляются отдельные изолированные бляшки, каждая из которых – результат репликации одной фаговой корпускулы. Для подсчета титра бактериофага следует количество бляшек умножить на то разведение, в котором эти бляшки подсчитаны.