О том, что ДНК является генетическим материалом, стало известно благодаря исследованиям Эйвери А.Т. и сотрудников (1944), вызвавшие трансформацию бактерий очищенными экстрактами ДНК пневмококков, а также
работами Херши А.Д. и Чейза М., которые обнаружили, что при заражении бактериальной клетки внутрь проникает только ДНК бактериофага, а его белковая оболочка остается снаружи. Усилиями ученых (биохимиков, биофизиков, генетиков, химиков и др..) В начале 50-х годов. была расшифрована пространственная структура ДНК; химический состав этих макромолекул был определен чуть раньше. Примерно в это же время удалось определить последовательность аминокислот в белке инсулине, состоящий только из 51 аминокислотного остатка. Таким образом, было убедительно доказано, что ДНК - это длинный неразветвленный полимер, состоящий из повторяющихся в разной последовательности четырех мономерных структур - дезокси-рибонуклеотидов, азотистые основания которых представлены аденином (А), цитозином (С), гуанин (G) и тимином (Т). Мононуклеоты-ди соединены между собой ковалентными фосфодиэфирных связей, идущих от 5-атома углерода одного остатка дезоксирибозы к 3'-атома углерода следующего пентозного остатка и образуют цепь - линейную последовательность.
Методом рентгеноструктурного анализа было установлено, что ДНК имеет форму спирали, которая состоит из двух цепей, расположенных таким образом, что азотистые основания оказываются внутри двойной спирали (ступеньки винтовой лестницы), а де-зоксирибозофосфатний каркас проявляется внешне (поручни этой лестницы). Оптимальное упаковки линейных последовательностей мономеров в полинуклеотидных структуре двойной спирали достигается за счет взаимодействия одной большой пуриновых оснований (аденина или гуанина), каждая из которых образована путем конденсации шестичленного и пятичленные гетероциклов, с меньшей по размеру пиримидиновых оснований (тимином или цитозином), которые является шестичленным гетероциклами.
Результаты модельных опытов показали, что между гуанином (G) и цитозином (С), а также между аденином (А) и тимином (Т) образуется более эффективных водородных связей, чем в любых других сообщений нуклеотидов. Комплементарное спаривание А с Т и G с С в двойной спирали ДНК пояснил ранее полученные результаты биохимических исследований ДНК о количественное равенство А с Т и G с С, то есть соотношение между азотистыми основаниями в приведенных парах во всех исследованных ДНК составляло 1:1. В результате биохимического анализа белков, являющихся продуктами мутантных генов, было показано, что последовательность четырех мономер-ных структур (аденина, гуанина, тимина и цитозина) в ДНК и двадцати аминокислот в белках коллинеарных, есть последовательность нуклеотидов в участке ДНК, кодирующего белок , соответствует последовательности аминокислот в этом белке. Следовательно, такое положение дел поднял вопрос, который стал главным в молекулярной биологии, о механизме такого биохимически сложного преобразования, как перевод последовательности нуклеотидов ДНК в последовательности аминокислот белка. Данная схема привлекла внимание ученых и впредь способствовала стремительному развитию биохимической генетики. Синтез молекул РНК называется транскрипцией ДНК; образована на матрице ДНК на одном из ее цепей, РНК-копия содержит в себе весь объем информации этого участка ДНК; РНК сохраняет способность к образованию водородных связей между комплементарными основаниями, потому что урацил, присутствует в РНК вместо тимина, спаривается с аденином так же, как и тимин. Зато транскрипция отличается от репликации. РНК-копия после завершения ее синтеза освобождается от ДНК-матрицы, вслед за чем происходит восстановление исходной двойной спирали ДНК; вновь синтезированные молекулы РНК имеют одноцепную структуру, она короче ДНК и соответствует длине того участка ДНК, которой достаточно для кодирования одного или нескольких белков. Одни участки ДНК (гены) используются для синтеза РНК тысячи раз, тогда как другие не транскрибируются совсем.
В клетках эукариот многие из молекул РНК, образовавшиеся во время транскрипции, прежде чем превратиться в информационную РНК (иРНК) и попасть в цитоплазму, подвергаются значительным химическим изменениям. В свою очередь, в цитоплазме на каждой молекуле иРНК могут синтезироваться тысячи копий соответствующего полипептидной цепи. Если при этом учесть, что скорость, с которой проходит процесс белкового синтеза, чрезвычайно высокая (полипептидная цепь, состоящая из ста аминокислотных остатков в клетке кишечной палочки создается в течение 5 с), то информация, содержащаяся в небольшом участке ДНК, способная реализоваться в виде большого количества определенного белка. Так, на матрице одного гена, кодирующего фиброина, происходит синтез 104 молекул иРНК, на каждой из которых получается 105 молекул фиброина, являющийся основным компонентом шелка. В целом за четыре дня одна клетка шовкосинтезуючои железы вырабатывает 109 молекул фиброина (Албертс Б. и др.., 1986).
Правила перевода последовательности нуклеотидов, входящих в полинуклеотидных структуру ДНК, в аминокислотную последовательность белков (генетический код) были расшифрованы в начале 60-х годов. Ниренберга М., Маттеи Г., Ледером Ф. и другими исследователями. В более ранних генетических экспериментах было показано кодирования аминокислот триплетами ну-клеотидив (кодонами). В этом случае из четырех азотистых оснований (А, Т, G, С) можно составить 64 (43) разные триплетные комбинации, которых вполне достаточно для кодирования 20 аминокислот. Если же из этого набора составить сообщение по два нуклеотида (дублетной код), то этого количества явно недостаточно для кодирования всего набора аминокислот. Инкубацией в пробирках смеси, состоящей из различных синтетических полирибонуклеотидив, экстракта кишечной палочки, двадцати аминокислот, из которых только одна имела радиоактивную метку, удалось установить весь набор триплетов для кодирования всех аминокислот. Кроме того, с помощью тринуклеотидив с известной последовательностью азотистых оснований была расшифрована нуклеотидная последовательность во всех кодо-нах, что обусловливает связывания различных аминоацил-тРНК.
Стоит также отметить работы Кораны Х.Г., который предложил метод химического синтеза поли-и олигонуклеотидов, и Холли Р.У., что расшифровал структуру тРНК с антикодовою участком.
До недавнего имеющийся фактический материал свидетельствовал об универсальности генетического кода, то есть во всех организмах - вирусах, прокариоты и эукариоты те же нуклеотидные триплеты кодировали одинаковые аминокислоты. В последние годы при изучении процесса биосинтеза белка в митохондриях были обнаружены отклонения от универсального кода (табл. 3.3). Для генетического кода характерна еще его вырожденность; в данном случае это означает, что аминокислоте соответствует более чем один кодон. Например, аргинина, лейцина и серина отвечает по шесть; глицина, пролина, валина, тирозина и аланина _ по четыре, а триптофана и метионина _ по одному кодона. Вследствие вироджености генетического кода ошибки, возникающие при репликации и транскрипции в некоторых случаях не сопровождаются искажением генетической информации и нарушением экспрессии, имеет биологическое значение. Во всех случаях двух-, трех-и четырехкратной вироджености изменение происходит только в третьем нуклеотиде триплета. Так, если аланин кодировался только одним триплетом ГЦУ, то любое изменение нуклеотидной последовательности в нем при репликации или транскрипции неизбежно сопровождалась бы заменой в соответствующей полипептидной структуре аланина другой аминокислотой со всеми вытекающими из этого последствиями. Однако благодаря четырехкратной вырожденными-сти только замены, касающиеся первых двух нуклеотидов кодона, ведут к изменению его значение. Специфичность кодонов определяется главным образом его первыми двумя нуклеоти-дами. Что касается третьего нуклеотида, который занимает положение на 3'-конце олигонуклеотидных структуры, то его специфичность выражена слабее (Ленинджер А., 1985; Бохинськи Р., 1987). Следует отметить, что количество катализирующих реакцию активации аминокислот аминоацил-тРНК-синтетаз соответствует количеству различных видов аминокислот, из которых синтезируются белки; что касается тРНК, то их количество как минимум должна достигать 32, потому что некоторые аминокислоты способны взаимодействовать с двумя, а то и с тремя различными тРНК, которые, в свою очередь, узнают и связывают один, два или даже три кодона иРНК. Кодон-антикодонове узнавания (кодон располагается на иРНК и имеет 5 / ^ 3/-ориента-цию, антикодон - на тРНК и ориентирован в направлении 3 '^ 5') предусматривает отклонения от классической взаимодействия и образования водородных связей между парами азотистых оснований А - Т, G - С и А-U в ДНК и РНК. Это отклонение сформулировано Криком Ф. в гипотезе колебаний, биологический смысл которой имеет много общего с явлением вироджености генетического кода. Гипотеза колебаний сводится к способности третий азотистого основания, расположенной со стороны 5'-конца антикодона (тРНК), менять свое пространственное положение, зато как две первые основы, находящиеся в 3'-конце антикодона, фиксированные более жестко. Изменение пространственной ориентации, находится на 5'-конце антикодона азотистого основания обусловливает его способность к образованию не соответствующих классическим (А - Т, G - С и А - U) взаимодействий между парами оснований. Установлено, что третьим от 3'-конца антикодона может быть U, G или I (рибонуклеозид инозин, в котором азотистой основой выступает гипоксантин, образующийся при отщеплении от аденина его 6-аминогруппы). В табл. 3.4 представлены возможные варианты сочетания пар оснований в связи с явлением колебаний.
Как видно из табл. 3.4, если в антикодон в положении колебания находится гипоксантин (в составе инозина), возможно распознавания и образования водородных связей трех пар: I - А, И - С и I - U (но такая комплементарное взаимодействие оказывается более слабая по сравнению с возникающей взаимодействием при образовании обычных пар G - С i А - U), в случае пребывания в позиции колебания G или U количество возможных сочетаний ограничивается двумя: G - С, G - U и U - А, U - G. Новые комбинации пар оснований не возникают, если такими, колеблющиеся является аденин и цитозин. В этом случае происходит образование связей по классическому принципу: А - U, С - G (рис. 3.7). Две первых основы кодонов (С _ G) образуют прочные (обозначены тремя черточками) уотсон-криковськи пары с соответствующими азотистыми основаниями антикодона. Азотистые основания, находящихся в третьем положении, (А, U, С) аргининових кодонов образуют слабые водородные связи (две черточки) с остатком ино-Зину (I) в антикодон. На основании этого и других примеров ко-дон-антикодонових взаимодействий Крик Ф. пришел к выводу, что основы большинства кодонов, которые находятся в третьем положении, имеют некоторую степень свободы при образовании пары с соответствующей азотистой основой антикодон, т.е., по терминологии Крика Ф., основы, которые колеблются. Биологический смысл явления заключается в том, что оно позволяет свести к минимуму возникающие ошибки. Благодаря непрочности связи, образующейся между основанием, которая колеблется, подходящей основой антикодона, тРНК легче освобождается из комплекса иРНК в процессе белкового синтеза. В случае привлечения в сильную уотсон-криковську кодон-антикодонову взаимодействие всех трех пар оснований прочность связи стала бы моментом, лимитирующим скорость белкового синтеза из-за замедления процесса высвобождения тРНК из комплекса с иРНК (Ленинджер А., 1985; Бохинськы Р., 1987 ).