Как и для любой другой структуры, стабильность нуклеосомы можно описать в терминах свободной энергии, которая характеризует вероятность реализации того или иного состояния той или иной системы. Снижение
свободной энергии всегда соответствует повышению вероятности - росту стабильности. Свободная энергия любой системы состоит из определенного набора стабилизирующих (с отрицательным знаком) и дестабилизирующих (с положительным знаком) взносов: баланс между ними и определяет степень стабильности.
Описаны в предыдущем разделе значительные деформации нуклеосомнои ДНК требуют энергетических затрат. Чтобы примерно оценить наиболее весомый дестабилизирующий взнос от изгиба ДНК, можно воспользоваться хорошо известным уравнением для энергии изгиба Gb эластичного стержня. где kT - энергия тепловых флуктуаций, a = 50 нм - так называемая персистентных длина ДНК (мера гибкости молекулы), s-общая контурная длина фрагмента ДНК, R - радиус кривизны, что в данном случае определяется радиусом и шагом нуклеосомнои суперспираль. По этому уравнению изгиб 133 пар оснований с радиусом кривизны 4,23 нм (исходя из параметров суперспираль, определяющие кривизну) требует 62 единицы kT. Кроме деформаций ДНК, еще одним дестабилизирующим вкладом в свободную энергию нуклеосомы является электростатическое расталкивания между соседними витками суперспираль ДНК.
Стабилизируют нуклеосому, компенсируя неблагоприятные взносы, несколько факторов. Первым является взаимодействия - прежде, электростатические - между ДНК и гистонами, содержащие деформированную двойную спираль на поверхности октамер гистонов. Но не менее важны гистона-гистонов взаимодействия, обеспечивающих целостность самого октамер. При этом последние, в первую очередь это касается взаимодействий между Дымер Н2А-Н2В и тетрамер (Н3-Н4) 2, зависят от электростатических ДНК-гистоновых взаимодействий - прочный контакт между диммером и тетрамеры возможно при условии нейтрализации положительных зарядов гистонов фосфатами ДНК. Иначе говоря, взаимодействие гистоновых комплексов с ДНК обеспечивает возможность образования октамер, и тогда изогнутый состояние нуклеосомнои ДНК поддерживается одновременно ее адсорбцией на поверхности комплексов и взаимодействием между самими комплексами. Соответственно, развертывание нуклеосомнои ДНК возможно двумя способами: или вследствие нарушения электростатических взаимодействий с гистонами, или путем нарушения гистона-гистоновых взаимодействий, например, в присутствии денатурантив, когда нуклеосомна ДНК разворачивается вместе со связанными с ней гистонами. Дополнительными факторами, стабилизируют структуру нуклеосомы, есть асимметричный нейтрализация зарядов двойной спирали гистонами с внутренней стороны изгиба (такая нейтрализация всегда способствует изгиба ДНК) и присутствие положительно заряженных неупорядоченных хвостов, которые снижают электростатическое расталкивания соседних витков нуклеосомнои суперспираль.
Среди указанных взносов в свободную энергию нуклеосомы только один - энергия деформаций двойной спирали - зависит от последовательности пар оснований, все остальные являются неспецифическими. Соответственно, нуклеосомы стремятся образовываться на таких участках ДНК, которые можно легче деформировать - именно такой механизм лежит в основе важного феномена преимущественного позиционирования нуклеосом относительно последовательности, который будет рассматриваться в разделе 4. Сейчас следует только заметить, что разница свободных энергий между различными позициями нуклеосом достаточно невысокой - в принципе, если "нет выбора", нуклеосома может сформироваться практически на любой естественной последовательности. Все неспецифические взносы в свободную энергию так или иначе зависят от ионной силы. Соответственно, изменения концентрации соли помогают изменить баланс свободной энергии в ту или иную сторону и тем самым выявить те или иные взаимодействия. Так, при очень низкой ионной силы (1-2 мМ NaCl) в нуклеосомы наблюдается так называемый низко-солевой структурный переход: развертывание концевых участков нуклеосомнои ДНК при сохранении контактов с ними димеров Н2А-Н2В (электростатические ДНК-гистоны контакты только усиливаться при снижении ионной силы). Движущей силой низко-солевого перехода является рост электростатического расталкивания между соседними витками нуклеосомнои суперспираль, которая, подобно пружине, разворачивается, разрушая контакты димера Н2А-Н2В с тетрамер (Н3-Н4) 2. Энзиматическое удаления неупорядоченных гистоновых хвостов (т.е. снижение степени нейтрализации отрицательных зарядов, прежде всего, на концевых участках нуклеосомнои ДНК) облегчает этот структурный переход, сдвигая его в несколько более высоких концентраций соли.
По физиологической ионной силы in vitro нуклеосома характеризуется высокой стабильностью. Электростатические взаимодействия настолько прочными, что исключают не только временную диссоциацию гистоновых комплексов, но даже трансляционные перемещения нуклеосомы вдоль ДНК (слайдингом). В связи с тем, что взаимное расположение ДНК и октамер гистонов является жестко детерминированным (предыдущий раздел), перемещения нуклеосомы требует появления высоко-энергетических интермедиатов (частичное развертывание нуклеосомнои ДНК или ее прокрутки по поверхности октамер). При физиологических условиях эти интермедиатов не является достоверным. Соответственно, изменение позиций нуклеосом в клетке требует наличия специальных АТР-зависимых молекулярных машин - комплексов ремоделирования хроматина (раздел 5), облегчающие образование таких интермедиатних состояний.
В диапазоне 0,3-0,6 М NaCl наблюдается диссоциация от ДНК неупорядоченных гистоновых хвостов, а также эффективный слайдингом нуклеосом: в указанных условиях свободная энергия интермедиатних состояний становится сопоставимой с энергией тепловых флуктуаций, что делает возможными изменения позиций нуклеосом вдоль ДНК. Соответственно, рост температуры также повышает эффективность слайдингом. Дальнейший рост концентрации соли индуцирует двухступенчатую диссоциацию нуклеосомы: в диапазоне 0,7-1,2 М NaCl диссоциирует димеры Н2А-Н2В, в 1,22,0 М NaCl - тетрамер (Н3-Н4) 2, который вообще является одним из наиболее прочно связанных с ДНК белков.
Поскольку электростатические взаимодействия между ДНК и гистонами при физиологических условиях очень прочные, связывания гистонов с ДНК является практически необратимым - очень высокая константа связывания (см. ниже) делает невозможной равновесие между связанными и диссоциированной гистонами. Соответственно, хотя структура нуклеосомы соответствует минимуму свободной энергии, этого минимума невозможно достичь за разумный промежуток времени: при смешивании гистоны быстро и беспорядочно связываются с ДНК без дальнейшей диссоциации. Реконструкция нуклеосомы in vitro возможна путем постепенного снижения концентрации соли в смеси ДНК и гистонов от 2 М до физиологических или более низких значений с помощью ступенчатого диализа. В таких условиях при промежуточных концентраций соли, когда электростатические взаимодействия еще не слишком эффективными, происходит равновесное связывание и формирование нуклеосомнои структуры. Снижение ионной силы "замораживает" эту структуру.
Для реализации равновесных условий ДНК-гистоновых взаимодействия in vivo в хроматине существуют промежуточные акцепторы гистонов-хроматина шапероны, выполняющие роль факторов сборки / разрушения нуклеосом, которые упоминались в разделе 2. Эти акцепторы имеющие сродство к гистонов немного меньше, чем родство гистонов к ДНК (рис. 3.5), что и обеспечивает возможность равновесного обмена гистонами между ДНК и промежуточными акцепторами со смещением этого равновесия в сторону ДНК-гистоновых комплексов. Наличие промежуточных акцепторов гистонов приводит к возможности обмена Дымер Н2А-Н2В между различными нуклеосомы: временное удаление димеров является важным путем структурной динамики хроматина в клетке. Стабильность нуклеосомы может быть испытана с помощью механических манипуляций с индивидуальными молекулами. Одна из таких техник использует так называемую оптическую ловушку. Оптическая ловушка создается лазерным лучом, сфокусированным в определенной точке, где содержится небольшая полистиренова шарик, пришита к концу молекулы ДНК. Другой конец пришивают, например, до кончика микропипеткы, что может двигаться, благодаря чему создается растягивающее сила разной величины. В работе Mihardja et al. (2006) с помощью техники оптической ловушки исследовалось растяжение внешней силой молекулы ДНК, на которой находилась одна нуклеосома. Вследствие закручивания ДНК в нуклеосомы, общая длина такой конструкции в растянутом состоянии меньше суммарной контурную длину ДНК, и нуклеосома сопротивляется конечном растяжению этой контурной длины. Окончательное растяжения реализуется при увеличении растягивающие силы и происходит в два этапа. Первый этап соответствует развертыванию концевых участков (в нуклеосомы остается ~ 1 виток суперспираль), второй-развертыванию центрального витка нуклеосомнои ДНК (рис. 3.6). Второй переход сложно анализировать количественно, потому что он характеризуется гистерезисом - возвращение к исходному состоянию при уменьшении растягивающие силы происходит с опозданием, при меньшем значении силы, чем та, при которой переход начинался. Но первый переход описывается стандартной моделью двух состояний: за промежуточного постоянного значения силы длина молекулы осциллирует между двумя значениями, которые соответствуют двум состояниям. Анализ полученных зависимостей позволяет оценить константы скорости прямого и обратного перехода, а следовательно и константу равновесия, в отсутствии растягивающих силы. Оценки указывают, что спонтанное развертывание концевых участков (длиной по ~ 30 пар оснований) нуклеосомнои ДНК является редким событием: в развернутом состоянии нуклеосома проводит ~ 17 мс против ~ 44 мин в компактном состоянии. Разница свободных энергий между двумя состояниями составляет ~ 12 единиц kT Экстраполяция этой величины ко всей нуклеосомы дает грубую оценку свободной энергии образования нуклеосомы -30 kT, что соответствует экстраординарно высокой константе равновесия ~ 1013 м-1. Если учесть оценен выше наиболее весомый дестабилизирующий взнос от изгиба ДНК, стабилизирующие взносы в свободную энергию нуклеосомы должны составлять -90 kT.
При этом эффективность взаимодействий ДНК с поверхностью октамер гистонов не является однородной по длине. Об этом свидетельствует хотя бы очень разная концентрация соли, необходимой для диссоциации димеров Н2А-Н2В и тетрамера (Н3-Н4) 2 (см. выше). Относительную слабость взаимодействий на концах нуклеосомнои ДНК указывает также различна термостабильность нуклеосомнои ДНК: вообще гистоны играют роль "скрепки" (повышают температуру плавления двойной спирали по сравнению со свободной ДНК), но при этом центральные участки нуклеосомнои плавятся при более высоких температурах, чем конечные. Прямую оценку относительной силы ДНК-гистоновых взаимодействий по длине нуклеосомнои ДНК было осуществлено с помощью еще одной из современных техник манипуляций с индивидуальными молекулами - расстегивание двойной спирали (unzipping). Схему эксперимента приведены на рис. 3.7: на двухцепной молекуле ДНК находится нуклеосома, конец одной цепи зафиксирован в оптической ловушке, конец другого пришит к поверхности стекла, что движется. Под действием внешней силы двойная спираль раскручивается, а взаимодействия ДНК с гистонами заставляют стекло затормозиться на определенное время - раскрутке предшествует отрыв двойной спирали от поверхности октамер гистонов. Время торможения отражает силу ДНК-гистоновых взаимодействий, а расстояние между двумя одноцепочечной концами ДНК, на которой это торможение происходит, - точку вдоль нуклеосомнои ДНК, где реализуются эти взаимодействия. Результаты показывают, что торможение происходит с периодичностью в ~ 5 нуклеотидов, отражая взаимодействия гистонов с двумя цепями ДНК. Слабые ДНК-гистоны контакты имеют место в SHL ± 6,5 (см. рис. 3.1); относительно слабые контакты - в SHL ± 5,5, а также ± 3,5 и ± 2,5; зона более сильных контактов находится в окружении SHL ± 4,5; прочные контакты реализуются на участке между SHL -1,5 и + 1,5.
Приведены данные о структурных преобразований нуклеосомы касаются достаточно экстремальных, вполне нефизиологических воздействий. Однако они указывают на некоторые "слабые места" в структуре, в которых можно ожидать перестроек нуклеосомы в физиологических условиях. Таких мест можно назвать по крайней мере два: концевые сегменты нуклеосомнои ДНК, наименее прочно стабилизированные в нуклеосомы, и контакты между Дымер Н2А-Н2В и тетрамер (Н3-Н4) 2.