Ферменты проявляют свою активность не только в микропространстве клетки, но и вне организма. Они исключительно активными и специфическими катализаторами, которые имеют недосягаемую для химических катализаторов активность и избирательность и, кроме того, ускоряют много реакций, для которых вообще не
известны химические катализаторы. Поэтому практическое использование ферментов открывает огромные возможности для разработки многих химических процессов, которые идут в мягких условиях с высоким выходом целевых продуктов. Однако, во-первых, ферменты, идеально приспособлены для работы в живой клетке и в случае исключения из своего окружения становятся очень неустойчивыми и не могут функционировать достаточно длительный срок. Во-вторых, ферменты, как правило, являются гомогенными катализаторами, очень неудобно с технологической точки зрения, поскольку такой катализатор трудно отделить от продуктов реакции и использовать снова. В-третьих, некоторые химико-технологические процессы желательно проводить при повышенной температуре, например, для того, чтобы не допустить загрязнения продуктов синтеза (особенно лекарственных препаратов) микрофлорой; однако с повышением температуры стабильность ферментов катастрофически снижается. Кроме того, очень часто нужны органические вещества можно получать с высоким выходом лишь в том случае, когда реакция идет исключительно в среде органического растворителя. Но в этих условиях обычные ферменты также не способны нормально работать и быстро теряют каталитическую активность. Из этого следует, что фермент, выделенный из живой клетки, требует значительного совершенствования.
За последние 15-20 лет проблему удалось решить, и ферменты стали полноправными компонентами технологических схем производства. Это было достигнуто путем развития методов иммобилизации ферментов, то есть фиксации их на каких-то нерастворимых материалах, предотвращают разрушение ферментов, увеличивают срок их действия, превращают их в гетерогенный катализатор (например, в виде зерен).
Во иммобилизацией понимают такую процедуру, в результате которой молекула фермента тем или иным способом прикрепляется к определенным объектам (носителей), нерастворимых в воде (англ. immobilis - неподвижный). Эти объекты вместе с ферментом легко отделяются от раствора после завершения реакции. Химическое «пришивания» фермента к носителю закрепляет конформацию фермента, и является причиной повышения устойчивости и снижения лабильности.
Иммобилизованные ферменты есть вроде модели структурно организованных в клетке ферментов (мембрана - это та же нерастворимое основание для сообщения с ферментом). Примерно в 70-х гг XX в. на стыке определенных химических и биологических дисциплин сформировался новый научно-инженерный направление: инженерная энзимология (важнейший раздел биотехнологии), стремительное развитие которой обусловил создание новых типов гетерогенных биоорганических катализаторов - иммобилизованных ферментов.
Ферменты и ферментные системы традиционно применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильной, меховой, кожевенной и других отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе. Последние годы ферменты стали применять для осуществления таких реакций органической химии, как окисление, восстановление, метилирования, ацетилирования, дезаминирование, декарбоксилирование, дегидратация, конденсация для разделения и отделения изомеров т.д.. Уже сейчас стало очевидным, что применение биокатализа в тонком органическом синтезе открывает путь к безотходных и низкотемпературных процессов, протекающих к тому же в неагрессивных средах. Нет сомнений, что внедрение биокаталитический процессов в химическую технологию неизбежно будет способствовать экономии сырья и энергии, уменьшению вреда, современная промышленность наносит окружающей среде. Овладение тонкими механизмами действия ферментов, несомненно, предоставит неограниченные возможности получения в огромных количествах и с большой скоростью полезных веществ в лабораторных и заводских условиях почти со 100% выходом.
Такое широкое применение ферментов способствовало налаживанию промышленного их получения в больших количествах. Сырьем для этого служат ткани различных растений и животных, но чаще - микроорганизмы, которые выращивают на селективных средах. Кроме того, микроорганизмы быстро накапливают свою биомассу, поэтому для их культивирования могут быть использованы дешевые питательные среды. Например, методами селекции, мутагенеза и генной инженерии удалось получить штаммы различных видов бактерий, продуцирующих те или иные ферменты в больших количествах: иногда с выходом более 50% от общей массы клеточного белка.
Таким образом, иммобилизованные ферменты - это искусственно полученный комплекс фермента с нерастворимым в воде носителем. Однако, понятие «иммобилизация» необходимо понимать шире, то есть как любое ограничение свободы движения белковой молекулы фермента в пространстве. Кроме связывания с нерастворимым носителем, этого можно достичь, например, путем внутримолекулярной или межмолекулярного «сшивки» белковых молекул фермента низкомолекулярными бифункциональных реагентами или присоединением фермента к растворимого полимера (рис. 48).
Иммобилизация осуществляется путем физической адсорбции ферментов на нерастворимом материале; включением ферментов в ячейки геля, а также ковалентной связыванием фермента с нерастворимым материалом или молекул фермента между собой с образованием нерастворимых полиферментные комплексов. Как адсорбенты используют стекло, силикагель, гидроксиапатит, целлюлозу и ее производные, хитин, дек-страни и др.. Для включения фермента в ячейки геля используют разнообразный гелеобразующий материал, чаще полиакриламидный гель. Как материал для ковалентного связывания ферментов применяют полипептиды, белки, производные стирола, полиакриламид, нейлон, различные производные целлюлозы, крахмал, агар, агарозу, а также стекло, силикагель и т.п.. При ковалентной связке ферменты находятся на химическом поводке у нерастворимого носителя.
При иммобилизации ферментов используют те же принципы, что и при аффинной хроматографии. Аффинная хроматография основывается на биоспецифического взаимодействия биополимера, выделяемой или группы полимеров с определенной веществом. Этот вид хроматографии применяется к ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков, которые способны избирательно по типу комплементарности связываться с субстратами, рецепторами, антигенами, ингибиторами, кофакторами. Принцип этого метода хроматографии состоит в том, что на нерастворимом носителе закрепляют вещество, способное специфически связываться с белком, выделяется, в частности, ферментом. Это вещество называют лигандом. Обработанный таким образом носитель (адсорбент) помещают в колонке и через нее пропускают смесь белков. С адсорбентом связывается только тот белок, который имеет сродство со специфическим лигандом (рис. 49). Затем белок снимают с колонки раствором, вызывает диссоциацию комплекса, который образовался между белком и лигандом.
По сравнению с нативными предшественниками иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ при их использовании с прикладной целью.
Во-первых, иммобилизованный фермент как гетерогенный катализатор можно легко удалить с реакционной среды, что дает возможность:
- Остановить в нужный момент реакцию;
- Еще раз использовать катализатор;
- Получить продукт, не загрязненный ферментом, что особенно важно для пищевого и фармацевтического производства.
Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет осуществлять ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колонках, и регулировать скорость реакции, которую катализируют, а также выход продукта путем изменения скорости потока.
В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленной изменении свойств катализаторов, в том числе его специфичности, зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, и, что очень важно, его стабильности относительно разного рода денатурирующих воздействий.
В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под влиянием некоторых физических факторов (свет, звук и др.).. На этой основе создаются механико-звукочутливи датчики, усилители слабых сигналов и безсрибляни фотографические процессы.
Основные требования, которым должны соответствовать носители:
- Высокая химическая и биологическая стойкость;
- Высокая механическая прочность;
- Достаточная проницаемость для фермента и субстратов;
- Высокая пористость;
- Возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т.д.);
- Легкое перевода в реакционно-способную форму (активация):
- Высокая гидрофильность, которая обеспечивает возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде;
- Невысокая стоимость.
Как носители для иммобилизации ферментов белки используют при фундаментальных биохимических исследований, а также с практической целью, особенно в медицине. С точки зрения практического значения важными свойствами белковых носителей является высокая емкость относительно ферментов, способность к биодеградации, а также возможность применения некоторых из них (благодаря фибриллярных природе), в виде тонкой (толщиной 80 мкм) пленки (мембрана). Иммобилизацию на белковых носителях можно проводить и в отсутствии, и в присутствии сшивающих агентов.
К недостаткам белков как носителей медицинских препаратов для использования in vivo следует отнести высокую иммуногенность (исключение составляют коллаген и фибрин).
Чаще как носители используются структурные белки (кератин, фиброина, коллаген) двигательные белки (миозин), а также транспортные белки, например, сывороточный альбумин.