Бактериальные препараты
Бактерии, как правило, способны расти на искусственных питательных средах, что упрощает производство препаратов на их основе. За пищевыми потребностями различные виды бактерий, которые представляют интерес
для биологической защиты растений, существенно различаются. Среди них есть формы, для которых еще не разработаны питательных сред, в связи с чем усложняется промышленное производство препаратов на их основе. В таких бактерий следует отнести возбудителей молочной болезни пластинчастовусих жуков. В производстве препаратов на основе этих микроорганизмов используют живых насекомых.
Препараты на основе Bacillus thuringiensis и других бактерий, хорошо растут на искусственных питательных средах, изготавливают в заводских условиях за использование современного технологического оборудования. Существенные технологические проблемы при этом связаны с получением биологически активных, фагостийких и продуктивных штаммов бактерий, обеспечением их элементами питания, применением оптимальных схем культивирования и переработки сырой биомассы. С производственными штаммами микроорганизмов ведется постоянная селекционно-генетическая работа. Используются только высокоэффективные против целевых групп фитофагов, наиболее полно отвечающие технологическим и экономическим требованиям. Среди этих критериев - прежде пригодность к массовому размножению по необходимости в элементах питания, стабильность образования полезных компонентов (спор, токсинов, ферментов) и устойчивость к разрушительному действию фагов. Штаммы, соответствующие этим производственным требованиям, выделяют из природных источников (нематод, насекомых, грызунов), а также получают с помощью современных селекционно-генетических методов. Культуры бактерий хранят в лиофилизированном состоянии. В процессе производства бактерии воспроизводят несколько десятков поколений, в результате чего они могут меняться, например, диссоциировать. Метаболизм бактерий (синтез токсинов, накопление биомассы) в решающей степени определяется условиями их выращивания, поэтому при производстве препаратов предъявляются высокие требования к качеству питательных сред и поддерживается оптимальный режим ферментации.
Клеткам бактерий для нормального роста необходимы вода, углерод, азот, минеральные элементы и условия роста. Наиболее экономичными и доступными источниками углерода являются углеводы, используемые в микробиологических производствах. Азотное питание бактерий обеспечивается отдельными аминокислотами. Самые при этом с экономической точки зрения богатые белком материалы растительного и животного происхождения (соевая мука, кукурузный экстракт, гидролизаты казеина и т.п.).
Из минеральных элементов для роста бактерий необходимы калий, магний, фосфор, сера и микроэлементы - цинк, железо, кобальт, медь и другие.
Функцию регуляторов роста выполняют витамины.
Для получения максимально возможной массы бактерий в условиях производства необходимо соблюдение определенных культуральных условиях: pH среды, достаточное количество кислорода, оптимальная температура.
Процесс выращивания бактерий в производственных условиях называется ферментацией. Крупнотоннажное производство бактериальных препаратов для защиты растений на предприятиях микробиологической промышленности осуществляется методом глубинной ферментации. При этом используют глубокие закрытые чаны (ферментаторы) вместимостью более 200000 литров. Воздух, питательная среда, посевную культуру подают в Ферментатор стерильно. Погружены турбинные крыльчатки интенсивно смешивают содержимое ферментатора. Водяные рубашки или охлаждающие змеевики регулируют температуру. Пиноутво-ния в ферментаторе избегают благодаря добавлению масел, поли-гликолей или силиконовых пеногасителей.
По объемной глубинной ферментации для инокуляции ферментационного среды используют культуру, выращиваемую в поэтапно растущих объемах, сначала в колбах на качалке, затем - в небольшом ферментаторе.
Конечный продукт удаляют при помощи центрифугирования, фильтрации, адсорбции и другими методами, зависит от свойств самого материала (рис. 66).
Сейчас промышленным путем выпускают инсектицидные бактериальные препараты практически только на основе различных вариантов Bacillus thuringiensis. В промышленно развитых странах насчитываются десятки таких препаратов, условно делятся на три ирупы. К первой группе относят биопрепараты типа лепидоцид, содержащие как действующее начало споры бактерии и кристаллы эндотоксина. Из отечественных препаратов, кроме лепидоцид, сюда входят ентобактерин, БИП, Инсеко-тин, гомелин. За рубежом известны дипел, турицид, биотро-ВТВ (США), спореин, бактоспеин (Франция), Батурин (Чехия), бактукал (Югославия), диспарин (Болгария) и другие.
Вторая группа препаратов наряду со спорами и кристаллами эндотоксина содержит еще и термостабильный экзотоксин. До сих бактериальных препаратов относится отечественный препарат биток-сибацилин.
И, наконец, инсектицидные препараты могут содержать очищенные токсины. В частности, в Румынии производят на культуральной жидкости Bacillus thuringiensis препарат туринтакс, содержащий экзотоксин. В Японии получают препараты на основе чистых кристаллов эндотоксина.
Дендробацилин предложенный Иркутским государственным университетом. Основой препарата является энтомопатогенных споротворна бактерия Bacillus thuringiensis subar. dendrolimus (Talalaev) Krieg (Syn.: Bacillus dendrolimus Talalaev), что относится к четвертому серотипа. Впервые микроорганизм выделил профессор Иркутского университета Е.В. Талалаев 1949 года с гусениц шелкопряда сибирского, погибших в природных условиях. По искусственного заражения гусениц хозяина он вызывает септицемию.
Морфология клеток - палочки с закругленными концами размером 1,0-1,5 и 2,0-6,0 мкм, образуют цепочки по 2-6, редко 8-10 клеток. Споры овальные, величиной 1,0-1,3 мкм, размещаются субтерминально или ексцентрально. Наряду с спорой образуются включения эндотоксина, обычно - в виде бипирами-дальних кристаллов.
Сапрофит при росте на искусственной питательной среде образует токсины, активные в отношении насекомых.
В мясо-пептонному бульоне образует пленку из хлопьев и легкую однородную муть, а также незначительный осадок. Рост на мясо-пептонному агаре обильный. Молодые колонии крупные, белые, плотные, блестящие, светонепроницаемые, структура мелкозернистая. При старении колонии теряют блеск, приобретая серовато-кремового окраса. Края колоний с бахромой, вязкой консистенции, клейкие. Колонии легко смываются водой.
Бактерии интенсивно разжижают желатин без газообразования. На кусочках картофеля хорошо растут, при этом обычно края колонии с бахромой, поверхность молодых культур слабкоблискуча, что со временем становится матовой и кремовой, быстро пептонизуе молоко, затем медленно сворачивается. Образует аммиак и не образует индола и сероводорода. Образует кислоту из лактозы, глюкозы, мальтозы и сахарозы, а также - ацетилметилкарбинол и лецитиназой. Некоторые штаммы вида производят термостойкий В-экзотоксин.
Продуцент дендробацилин, как и другие культуры B.thuringiemis, из-за многократного пересев на мясо-пептонному агаре и хранении теряет энтомопатогенных активность. Е.В. Талалаев разработал способ сохранения биологической активности исходного штамма в сухом порошке трупов гусениц шелкопряда сибирского. При этом суспензию заспорованои культуры В. thuringiensis subar. dendro limus наносят на хвою лиственницы или кедра, кладут в сад, куда подсаживают гусениц шелкопряда сибирского. Гусеницы, поедая корм, заражают-ся и погибают. Трупы их высушивают в эксикаторе над хлористым кальцием при комнатной температуре в течение 10-12 суток, после чего растирают в порошок, который хранят в склянках с притертой пробкой. В таком состоянии исходный штамм сохраняется в течение многих лет.
Технология производства дендробацилин совершенствовалась и неоднократно менялась. Особенно это касается питательных сред и способа сушки биомассы. В 1952 году в Иркутском университете поверхностным способом на мясо-пептонному агаре было получено партию дендробацилин с титром 5 млрд / г спор и 5 млрд / г кристаллов эндотоксина. В 1958 году заводским способом произведено 3,2 т препарата с использованием как компонентов питательных сред кукурузного и пшеничного экстрактов и мелассы. Позже была разработана технология с использованием кукурузного экстракта и технической глюкозы. К началу 80-х годов биомассу дендробацилин высушивали за лиофильной сушки из замороженного состояния, а ныне сушат в распылительной сушилке при непродолжительном высокой температуре.
Производство дендробацилин состоит из нескольких операций. Одна из первых - приготовление посевного материала. Для этого берут производственную заспоровану культуру, засевают ней жидкое питательную среду в колбах и выращивают за 30 ° С в течение 48 часов до завершения спорообразования. Полученный таким образом материал используют для посева в ферментеры, или дальше размножают в посевных аппаратах при аэрации и перемешивании в течение 35-40 часов до завершения споруляции. Наращивают биомассу в ферментерах на питательной среде, содержащей как основные питательные элементы кукурузную муку и кормовые дрожжи. Ферментацию осуществляют в течение 35-40 часов при постоянной аэрации и перемешивания. Культуральную жидкость сгущают до пастообразного состояния на сепараторах. Для получения сухого дендробацилин пасту высушивают в распылительной сушилке, мелющие и добавляют наполнителя. Таким образом, в готовом препарате содержатся бактериальные споры, кристаллообразным включения эндотоксина, вегетативные клетки, не завершили спорообразования, а также остатки кукурузной муки, дрожжевых клеток и инертный наполнитель. Сухой дендробацилин - это светло-серый порошок с содержанием влаги не менее 5%. Титр препарата, то есть - количество жизнеспособных спор в 1 г, составляет не менее 60 млрд, такое же количество и кристаллов эндотоксина. Срок хранения - 1,5 года со дня изготовления. Препарат может быть использован, если в конце срока хранения титр жизнеспособных спор уменьшится, но биологическая активность их сохранится. Снижения титра увеличивают нормы расхода в соответствии с наличием живых спор.
Хранят препараты отдельно от ядохимикатов в сухих складских помещениях при температуре окружающей среды.
При хранении дендробацилин и других микробиологических препаратов, производимых на питательных средах с великозернис-теми компонентами, которыми, например, являются мука и дрожжи, следует оберегать препараты от переувлажнения, поскольку имеющиеся в них органические компоненты становятся субстратом для плесневых грибов и гнилостных бактерий, продуктами метаболизма и производимыми ферментами деградируют белковый эндотоксина. При повышенной влажности жизнеспособность бактериальных спор снижается. Это касается и спор В. thurindiensis. Особенно резко снижается активность микробиологических препаратов за сочетание повышенной влажности и температуры в пределах 15-35 ° С, при которой размножается большинство мезофилы-ных микроорганизмов.
При соблюдении необходимых правил партии сухого дендробацилин, изготовленного на разных заводах, в различных климатических условиях не слеживаются течение 7-8 лет, а титр их почти не снижается (Кулагин и др.., 1978). Лишь при хранении в течение 11 лет титр снижается в 2,5 раза. Проверка биологической активности партий препарата на гусеницах шелкопряда сибирского за дозированного заражения и инфицирования через корм, опрыснутые суспензией, содержащей 1,0-1,5 млрд / мл спор показала: на 10-й - 15-й день после заражения смертность гусениц составляла 80 -100%. Авторы пришли к выводу, что продолжительность хранения препаратов определяется не климатическими условиями, а особенностями технологии их производства. Это, очевидно, связано с составом питательных сред и способом высушивания, при которых сублимация наибольшей степени пригодна для сохранения жизнеспособности и активности действующих компонентов.
Ентобактерин предложил бывший Всесоюзный институт защиты растений. Действующим началом его является бактерия Bacillus thuringiensis subsp. galleriae Heimpel. Бактерию впервые выделены из гусениц ВОЩИННЫЙ моли. Bacillus thuringiensis subsp. galleriae отличается от других подвидов Bacillus thuringiensis сочетанием таких признаков: она образует ацетилметилкарбинол, слабо гидролизует белки и интенсивно разлагает ексулин и крахмал, усваивает салициловые и не усваивает сахарозы и маннозы, не производит пигмента на яичном желтке, ее Базальное антиген относится к серотипа 5а-5в , она, как правило, не содержит термостойкого экзотоксины и не производит лецитиназы.
Технология производства ентобактерину мало чем отличается от технологии производства дандробацилину.
Сухой ентобактерин являются светло-серым порошком с содержанием влаги не более 5%. При просеивании сквозь сито № 009 количество остатков не превышает 5%. Титр - не менее 30 млрд / г спор и столько же - кристаллов эндотоксина. Выпускают партии препарата и с чуть выше титром. Коэффициент биологической активности, определенный на гусеницах моли ВОЩИННЫЙ по стандартной методике, составляет не менее 1,0.
Ентобактерин хранят отдельно от ядохимикатов в сухих неотапливаемых помещениях. Рекомендуемая температура хранения - от -30 до +30 ° С. Гарантийный срок хранения - 1,5 года со дня изготовления.
Лепидоцид - бактериальный отечественный препарат, созданный на основе Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Krywienczyk Dulm., et F. Подвид продуцирует кислоту с салицина, образует уреазу и не образует пигмента. Выпускают его в форме сухого концентрированного порошка с титром 100 млрд / г спор и такого же количества эндотоксина.
Институт микробиологии Академии наук Армении разработал и предложил микробиологической промышленности препарат БИП на основе бактерии Bacillus thuringiensis subsp. caucasicus (по международной номенклатуре - Bacillus thuringiensis subsp. dermstadiensis), выделенной впервые гусениц шелкопряда тутового.
Бактерия имеет следующие признаки: производит пигмент на яичном желтке, не сбраживает салицина, образует пленку на мясо-пептонному бульоне, гидролизует крахмал, дает положительную реакцию Фок-о-скауера, производит лецитиназой, не образует термостойкого токсина. От других форм Bacillus thuringiensis кавказский подвид отличается по серологическими реакциями.
Препарат выпускают в таких же препаративных формах, как и другие отечественные препараты.
Инсектин создан Институтом леса и древесины Сибирского отделения Академии наук бывшего СССР. Выпускают его на основе Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, выделенной А.Б. Гукасяном из больных и погибших гусениц шелкопряда сибирского. Бактерия производит термостойкий экзотоксин. При изготовлении инсектину по технологии ентобактерину этот токсин не включается в отдельного препарата. Инсектин по своим свойствам похожий на дендробацилин.
Гомелин создан в Белорусском ПИИ лесного хозяйства на основе Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis (Berliner Heimpel et Angus; Bacillus thuringiensis subsp. Berliner de Barjak et Bonnefoi) и предназначен для регулирования численности вредителей леса. Кроме перечисленных ендотоксинумисних препаратов, эффективных против чешуекрылых насекомых, в последнее время созданы препараты, активные против личинок жесткокрылых. Создание таких препаратов стало возможным после выделения нового подвида Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis Krieg, продуцирующая кристаллический эндотоксин со специфической инсектицидным активностью. Первый препарат - де-цимид на основе нового серотипа создан в бывшем ВНИИ карантина и H ВО «Биомаш» (Москва) на основе штамма, выделенного М.В. Чирковым.
Инсектицидные свойства относительно некоторых личинок двукрылых насекомых, в частности комаров и мошек, свойственна подвида Bacillus thuringiensis subsp. israelensis de Barjac. На основе этой ендотоксиноутворюючои бактерии в СССР вместе с чехословацкими специалистами создан препарат бактокулицид. Аналогичные препараты выпускают в Англии (Биомос) и Франции (бактимос). Эти препараты используют против личинок комаров и мошек.
Перечисленные бактериальные препараты, относящиеся по описанной выше классификации к первой группе, не имеют принципиальных отличий в технологии производства и характеристике препаративных форм.
Ко второй группе бактериальных инсектицидных препаратов, созданных на основе Bacillus thuringiensis, относятся битоксибацилин, созданный в Институте сельскохозяйственной микробиологии. Действующим началом его являются споры, эндо-и экзотоксины. Битоксибацилин производят на основе Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis (Berliner Heimpe! et Angus), отличающийся от других серотипов этой группы бактерий сочетанием таких признаков: продуцирует термостабильный экзотоксин, образует кислоту из салициловые, сахарозы и маннозы, гидро-лизирует крахмал и эскулин, содержит лецитиназой, не производит пигмента на яичном желтке , не содержит уеразы и образует пленку на питательной бульоне.
При производстве битоксибацилину биомассу производственной культуры наращивают в ферментерах на среде, содержащей как основные питательные элементы кукурузную муку или кормовые дрожжи, гидратную глюкозу и кукурузную муку, а также нетоксичные минеральные соли. Технологический цикл производства битоксибацилину примерно такой, как и ентобактерину. После ферментации культу-рального жидкость содержит компоненты питательной среды, споры бактерий и токсины, высушивают в распылительной сушилке.