Строение активного центра антител изучали разными методами.
1. Фотоафинна и спиновая метка. Принцип: к антигену вводили химическую группу, которая под действием облучения образовывала ковалентные связи с аминокислотными остатками, которые ее окружают. Затем комплекс антиген-антитело гидролизовали и определяли, с какой именно аминокислотой связана метка. Таким образом было обнаружено, что в состав активного центра антитела входят гипервариабильни аминокислотные остатки.
2. Было замечено, что связь антиген-антитело разрушается при изменении рН, ионной силы и при добавлении органических растворителей или хаотропних ионов. Так
19
сделано выводу, что связь антигена с антителом НЕ ковалентная, а ионный, водородный или гидрофобный.
3. Размеры активного центра изучали с помощью олигомеров аминокислот и углеводов различного размера. Так было обнаружено, что в активном центре антитела может поместиться 5-6 остатков аминокислот или глюкозы и размеры активного центра составляют, соответственно, у 15х6х8 ? (12х20 ?) и могут варьировать в разных антител.
4. То, что активный центр - это полость, нацелена на Fv фрагмент, было найдено с помощью би гаптена (два динитрофенола, разделенных разным количеством метиленовых радикалов). При добавлении антител к такому антигена под электронным микроскопом наблюдали характерные кольцевые структуры, образованные совпадением нескольких молекул антител, связали антиген. Такие структуры не образовывались, если длина спейсора была меньше 5 (СН2), то есть активный центр был углублен в Fv фрагмент примерно на 15 ?.
5. И, наконец, в 70-е годы было сделано рентген-структурный анализ миеломных иммуноглобулинов, который подтвердил данные, полученные ранее, и показал, что активный центр антитела - это полость, в образовании которой принимают участие гипервариабельные участки Fab фрагмента, сближены в третичной структуре .
Почему антиген связывается именно в активном центре, а не снаружи, хотя вполне возможны такие же комбинации аминокислотных остатков на поверхности белковой молекулы? Этот вопрос касается также активных центров ферментов. Работами Ричардса (1974) было показано, что атомная плотность в центре связывания ферментом субстрата значительно меньше, чем в других частях молекулы: химические группы могут двигаться с большим количеством степеней свободы. Такую же закономерность была найдена и для активных центров антител. Приняв во внимание, что повышенная атомная мобильность является признаком В эпитопов, можно сделать вывод, что родство друг к другу имеют именно наиболее гибкие, подвижные участки. Связь приводит к взаимной стабилизации, то есть энергетически выгодным (идет с уменьшением свободной энергии). Комплекс, который образовался, является более стабильным, чем его компоненты. Это подтверждено экспериментально антитела в комплексе с антигеном требуют для денатурации вдвое гуанидинхлориду, чем прежние антитела в свободной форме.
В 70-е годы было проведено моделирование активного центра антител путем синтеза, имитирующая поверхность. Так, по данным рентген-структурного анализа, в образовании активного центра антитела к фосфорилхолину (миеломной IgМ-603) принимали участие такие аминокислотные остатки:
61Н ..... 60Н ..... 52Н ...... 33Н ...... 35Н ...... 36н ....... 37н
Ser Tyr Arg Tyr Glu Trp Val
Было синтезировано пептид, который содержал эти остатки, соединенные глициновыми спейсорамы: Ser-Tyr-(Gly) 2 - Arg-Tyr-Gly-Glu-Trp-Val. Cинтетичний пептид связывался с фосфорилхолином и конкурировал с естественными антителами.
Далее такой подход был использован для моделирования активного центра белок-специфических антител, в частности в эпитопы лизоцима:
116 113 114 34 33
Lys Asn Arg Phe Lys
20
Lys-Asn-Arg-Gly-Phe-Lys - синтетический пептид
Asp-Gln-Asp-Gly-Leu-Asp - комплементарный пептид
Комплементарный пептид связывался с лизоцимом и конкурировал со специфическими антителами. Это не означало, что пептид полностью совпадает со строением активного центра, но он был построен по тому же принципу.
Таким образом, стало ясно, что основа высокой специфичности антител заключается в соответствующем расположении аминокислотных остатков в активном центре, изменение заряда или размеров антигенной детерминанты снижает эффективность связывания.
При дальнейшем изучении миеломных белков было установлено, что активный центр не является моноспецифический: в одном активном центре могут связываться структурно различные антигены. Впервые это было показано на белку МОРС 450, кроме динитрофенол связывал структурно похож менадион. При изучении широкого спектра неродственных гаптенов было выяснено, что вероятность их связывания в одном активном центре достигает 1 на 140. Они связываются в разных участках полости активного центра, достаточно большой для нескольких вариантов связывания гаптена.
Таким образом было доказано, что ограниченный репертуар антител может связывать большое, практически неограниченное количество антигенов. Тогда универсальный характер иммунного ответа требует конечного (104-106) репертуара вариантов антител.
Высокая вероятность связывания структурно различных антигенов одной молекулой антитела ставила вопрос об основе высокой специфичности иммунного ответа в целом: почему при специфической ответа не поражаются собственные или другие неродственные антигены? Ответом на это стало определение высокой гетерогенности антител. Иммунизация определенным антигеном приводит к появлению большого количества вариантов антител. Каждое из этих антител, кроме данного антигена, может узнать несколько других, но судьба его среди общей смеси невелика и поэтому вероятность эффективного распознавания неродственных антигенов низкая. С другой стороны, общим для всех вариантов выработанных антител является то, что они узнают друг антиген. Поэтому вероятность его эффективного связывания очень велика. Таким образом, специфичность иммунного ответа является интегральной величиной, которая состоит из многих долей различных антител, каждое из которых является полифункциональным. Чем больше клонов В клеток стимулировано, тем большая доля антител к определенному антигену и меньше - в другие неродственных антигенов. Это означает, что специфичность иммунного ответа является по сути популяционных явлением, а не свойством каждого члена популяции. Интегральная специфичность реализуется за счет гетерогенности антител.
Антитела по своей природе являются иммуноглобулинами. Они имеют симметричное строение молекулы, состоящей из двух типов цепей: тяжелой и легкой. Участки цепей заперт в домены, которые фактически являются единицами структуры этих белков. Различают вариабельным и константные домены. Вариабельным образуют активный центр антитела, который отвечает за связывание антигена. Константные домены отвечают за эффекторные функции антител: преципитацию токсинов и агглютинацию бактерий, опсонизации, активацию комплемента, дегрануляцию тучных клеток. Активный центр антитела - это полость, нацелена в Fv-фрагмент, который может связывать структурно различные антигены.
Есть четыре черты гуморального иммунного ответа, которые поражают и, на первый взгляд, исключают друг друга:
1) универсальность: антитела могут выработанными против любого химического группировки. Трудно представить, сколько должно быть вариантов антител, если считать, что каждый антиген требует отдельного антитела;
2) специфичность: антитела различают о-или р-положение функциональных групп, стереоизомеры, белки, отличающиеся на один аминокислотный остаток;
3) гетерогенность: на один антиген вырабатывается много типов (популяций) антител, иногда более 100 на одну антигенную детерминанту;
4) полифункциональность: одно антитело способно связывать более одного антиген.
Оказывается, что именно многофункциональность антител способствует универсальности иммунного ответа, а гетерогенность - ее высокой специфичности.