Методы преципитации в агаре позволяют определять микрограммов количества антигена.
Революционным шагом в иммунохимических анализе стало использование радиоактивных меток, начатое в 70-х годах, которое позволило повысить чувствительность метода на шесть порядков: стало возможным определять пикограмма количества антигена.
Первым изотопом, которым стали метить белки, был 131И. Работа с ним была сложной и опасной, потому что этот изотоп испускает жесткое гамма-радиацию и имеет очень короткий период полураспада - 8 суток. Позже перешли на более удобный изотоп 125И, который дает мягкое гамма-и бета-излучения и имеет период полураспада полтора месяца. Он легко присоединяется к тирозинових остатков в белках и по сей день широко используется в экспериментах. Если надо заметить белок, который синтезируется в исследуемых клетках, используют метионин, меченный 35S, который добавляется в культуральную среду и включается в синтезированные белки, это так и называется - биосинтетическая метка.
Радиоиммунный анализ (РИА) является мощным методом определения kА. Суть его заключается в том, что антиген, меченный радиоактивным изотопом, может быть легко количественно идентифицирован в любой смеси. Задачей является разделить связанный и свободный антиген. Для этого часто используют метод преципитации в растворе; осадок отделяют от растворимого антигена центрифугированием. Облегчить образования преципитата можно с помощью других антител (анти-иммуноглобулиновых) или высадив комплекс сульфатом аммония. Этот подход имеет определенные ограничения, поскольку некоторые антигены тоже высаживаются сульфатом аммония. Можно также использовать нерастворимые частицы (чаще всего используют гранулы агарозы), к которым пришит какой-то агент, связывающий антитела и их комплексы с антигеном. К таким агентам относятся белки А и G. Эти белки входят в состав мембран стафилококков и имеют свойство прочно связывать иммуноглобулины определенных классов с их Fc фрагмент. Эксперимент проводят таким образом. Сначала к антигену добавляют специфические антитела, инкубируют некоторое время вместе, чтобы образовался комплекс, а затем добавляют гранулы агарозы с белком А (G) и комплексы антиген-антитело отделяют от антигена, что не связался, путем центрифугирования. В осадке определяют связанный антиген, а в супернатанте - свободный.
В последние двадцать лет широко распространено сорбционные иммунологические методы. Суть их в том, что один из компонентов системы антиген-антитело сорбируют на твердой фазе (полистироле или нитроцеллюлозных). Комплекс антиген-антитело тоже образуется на твердой фазе и может быть от свободного антигена путем простого отмывания.
Радиоиммунного методы являются высокочувствительными, но все же опасны для людей, которые их используют, и требуют специальных мер защиты от радиации, специальных мер по сокрытию радиоактивных отходов. Распад изотопов тоже накладывает ограничения на их использование. Поэтому много усилий было приложено для того, чтобы разработать метод, который по чувствительности не уступал бы радиоиммунном, но был более удобным и опасным. Такими оказались иммуноферментные методы.
Суть этих методов состоит в том, что антитела ковалентно конъюгируют с ферментом, продукт реакции которого легко определить по окраске, флуоресценции, изменении кислотности или электрического потенциала.
Преимущество ферментной метки над радиоактивным заключается в том, что ферменты:
- Безвредные для здоровья человека;
- Стабильны при хранении;
- Реакция развивается со временем и количество накопленного продукта реакции со временем растет.
Наиболее распространенные ферменты, которые используются для метки, - пероксидаза и щелочная фосфатаза. Субстратом пероксидазы является перекись водорода. Как правило, к реакции добавляют так называемый хромогенных субстратов, который превращается в сопряженной реакции продуктом разложения перекиси водорода. В результате образуется окрашенный продукт, который можно идентифицировать просто глазом, под микроскопом или фотометрические, в зависимости от типа эксперимента. Для пероксидазы такими субстратами являются, например, о-фенилендиамин, диаминобензидин и ?-хлоро-1-нафтол.
Загрузка...