Биохимические свойства бактерий можно начинать изучать одновременно с выделением культуры, засевая материал на специальные питательные среды, позволяющие судить о биохимической активности выделяемых микроорганизмов.
Наиболее показателен в этом отношении культуральный метод диагностики инфекций, вызываемых энтеробактериями: так как сотни входящих в это семейство видов практически идентичны друг другу по морфологическим и культуральным свойствам, их биохимические свойства играют очень большую роль в процессе идентификации. Именно на этом примере мы и разберем данный вопрос.
А. На первом этапе патологический материал засевают на дифференциально-диагностические среды для кишечной группы бактерий. В состав этих сред, наряду с мясопептонным агаром, входит лактоза и индикатор. Если бактерия способна ферментировать лактозу (важный признак для дифференциации различных энтеробактерий), рН среды смещается в кислую сторону и индикатор окрашивает колонию в соответствующий цвет. В нашей стране наиболее распространены среды Эндо, Левина и Плоскирева; в других странах могут использоваться иные среды, принцип действия которых, однако, идентичен этим трем.
1. Среда Эндо (в англоязычной литературе “Endo Agar”) содержит в качестве индикатора основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия.
а. Лактозопозитивные колонии на среде Эндо – красные (кишечная палочка с типичной биохимической активностью образует на этой среде темно-красные колонии с металлическим блеском, схожим с блеском ртути).
б. Лактозонегативные колонии на среде Эндо бесцветные, но так как энтеробактерии образуют прозрачные и полупрозрачные колонии, то они могут приобретать оттенок той среды, на которой вырастают.
2. Среда Левина содержит К2НРО4, метиленовый синий и эозин. В англоязычной литературе более употребительное название для этой среды “Eosin Methylene Blue Agar”, иногда – “Eosin Methylene Blue Agar (Levine)”.
а. Лактозопозитивные колонии на среде Левина – насыщенного синего цвета.
б. Лактозонегативные колонии на среде Левина бесцветные.
3. Среда Плоскирева содержит кроме лактозы и индикатора (нейтрального красного) еще и брилли-антовый зеленый, соли желчных кислот, минеральные соли. Раньше эту среду часто называли «бактоагар Ж». За рубежом аналогом этой среды выступает “MacConkey Agar”.
а. Лактозопозитивные колонии на среде Плоскирева – красные.
б. Лактозонегативные колонии на среде Плоскирева бесцветные.
Б. На II этапе отобранную для дальнейшей работы колонию засевают на среды накопления и первичной дифференциации. Эти среды содержат уже несколько субстратов, по отношению к которым определяется ферментативная активность изучаемой бактериальной культуры, кроме того, эти среды формируются в пробирки так, чтобы получился участок со столбиком и участок скошенного агара. Изучаемая колония засевается в столбик уколом, а на скошенную часть среды – плотным штрихом.
1. Среда Рессела содержит глюкозу и лактозу.
а. Если культура ферментирует только глюкозу, не ферментируя лактозу, то измениться цвет только столбика, без изменения цвета скошенной части.
б. Если культура ферментирует и глюкозу и лактозу, то изменится цвет всей среды – и столбика и скошенной части.
2. Среда Клиглера содержит не только глюкозу и лактозу, но и ингредиенты, позволяющие определить наличие сероводорода.
а. Если культура ферментирует только глюкозу, не ферментируя лактозу, то измениться цвет только столбика, без изменения цвета скошенной части.
б. Если культура ферментирует и глюкозу и лактозу, то изменится цвет всей среды – и столбика и скошенной части.
в. Если культура продуцирует сероводород, место засева уколом чернеет.
3. Среда Олькеницкого по составу аналогична среде Клиглера, но в нее вводится еще и мочевина (с индикатором щелочения, так как при ферментации мочевины образуется аммиак). Эту среду называют еще «трехсахарным агаром», так как в ее состав входит еще и сахароза, однако отдельно ферментацию сахарозы на этой среде не определяют.
а. Если культура ферментирует только глюкозу, не ферментируя лактозу, то изменится цвет только столбика, без изменения цвета скошенной части.
б. Если культура ферментирует и глюкозу и лактозу, то изменится цвет всей среды – и столбика и скошенной части.
в. Если культура продуцирует сероводород, место засева уколом почернеет.
г. Наличие уреазной активности определяется по покраснению среды.
В. На III этапе биохимические свойства выделенной культуры изучаются более детально.
1. Сахаролитические свойства изучаются на средах Гисса. Среда Гисса представляет собой столбик полужидкого агара (засевается уколом), в состав которого входит определенный углевод и индикатор. Принцип действия среды Гисса аналогичен принципу действия вышеописанных сред, но так как среда полужидкая, то в положительном случае (ферментации данного углевода) она полностью меняет цвет. Конкретная световая гамма сред Гисса зависит от вводимого в их состав индикатора (индикатор Андреде обуславливает переход от синего, если углевод не утилизируется, к красному, при утилизации углевода; индикатор ВР – водный голубой и розоловая кислота – наоборот, от красного к синему и т.п.). Совокупность сред Гисса, используемых для засева бактериальной культуры, называется рядом Гисса или пестрым рядом.
а. Наиболее информативны при дифференциации энтеробактерий пять углеводов: лактоза, глюкоза, манит, мальтоза и сахароза. Пять сред Гисса с этими углеводами называют коротким рядом Гисса (во всех бактериологических лабораториях стран СНГ они располагаются в штативе именно в таком порядке, в котором они здесь перечислены, что позволяет легче визуализировать результат анализа).
б. В случае необходимости определяют способность изучаемой культуры ферментировать и большее количество субстратов (моносахаридов, полисахаридов, спиртов). Тогда говорят о длинном ряде Гисса.
2. Протеолитические свойства бактериальной культуры определяют, засевая ее на среды с белковыми субстратами (желатин, пептон и др.).
а. Желатин используется как показатель наличия или отсутствия у изучаемой бактериальной культуры протеолитической активности как таковой.
1. Если бактерии обладают протеолитической активностью, то они будут разжижать столбик желатина, засеваемый уколом. При этом для идентификации некоторых видов значение имеет и то, как именно разжижается желатин (послойно, перевернутой елочкой, воронкой и т.п.).
2. Бактерии, не обладающие протеолитической активностью, желатин не разжижают.
б. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) индол.
1. Для определения продукции бактериальной культурой индола применяется способ Мореля. Культуру засевают в мясопептонный бульон или пептонную воду (лучше с добавлением триптофана, при утилизации которого выделяется значительное количество этого газа) и под пробку помещают фильтровальную бумагу, пропитанную щавелевой кислотой.
а. При продукции бактериальной культурой индола нижняя часть бумажки краснеет.
б. Если культура не продуцирует индол – бумажка остается бесцветной.
2. Более надежен способ Эрлиха. В пробирку с изучаемой культурой добавляют специальный реактив.
а. В присутствии индола реактив краснеет.
б. Если индола нет – реактив остается бесцветным.
в. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) аммиак. Для выявления этого признака под пробку пробирки с засеянной питательной средой помещают лакмусовую бумагу так, чтобы она не касалась поверхности среды.
1. При образовании аммиака лакмусовая бумажка синеет.
2. Если аммиак не образовывается, лакмусовая бумажка цвет не изменяет.
г. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) сероводород.
1. С этой целью под пробку пробирки с засеянной питательной средой помещают фильтровальную бумагу, пропитанную ацетатом свинца.
а. При продукции бактериальной культурой сероводорода нижняя часть бумажки чернеет.
б. Если культура не продуцирует сероводород – бумажка остается бесцветной.
2. Однако, метод с использованием бумажки с ацетатом свинца не надежен и в настоящее время практически не используется. Продукцию бактериями сероводорода лучше определять с помощью сред Клиглера или Олькеницкого (см. выше).
2. В ряде случаев для идентификации выделенной бактериальной культуры необходимо определить продуцирует ли она конкретные ферменты. Чаще всего выясняется наличие оксидазной и каталазной активностей.
1. Каталаза, продуцируемая бактериями, будет разлагать перекись водорода на воду и кислород, выделение которого в виде пузырьков и регистрируется.
2. Если каталазной активности у бактериальной культуры нет, пузырьков не будет.