Этот метод относится к самым современным методам исследования, без которого не мыслима ни одна крупная микробиологическая лаборатория нашего времени.
А. ПЦР можно проводить для достижения трех целей.
1. Для обнаружения в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры.
2. Для идентификации выделенных чистых культур микроорганизмов.
3. Для генотипирования микроорганизмов, т.е. определения генетических вариантов одного вида.
Б. Принцип осуществления ПЦР заключается в увеличении (амплификации) количества искомого гена при положительной или (отсутствие такого увеличения) при отрицательной реакции.
Рис. 14.2-1. Принцип положительной ПЦР: экстракция ДНК и, если в ней содержится искомый ген, ее количество в процессе реакции резко увеличивается, что выявляется с помощью электрофореза
1. Сначала из патологического материала или культуры микроорганизмов выделяется ДНК.
2. Затем путем нагрева в щелочной среде ДНК расплетается на две отдельные нити.
3. После этого в реакционную смесь добавляют праймеры (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена).
4. Реакционную смесь охлаждают.
5. Если в исследуемой ДНК имеется искомый ген, то праймеры создают фрагменты двухцепочечной ДНК, связываясь с комплементарными участками «своего» гена.
6. Затем в реакционную смесь добавляют нуклеотиды и ДНК-полимеразу.
7. Если в реакционной смеси наличествуют двухцепочечные фрагменты ДНК, то нуклеотиды при-соединяются к 3’-концам праймеров, полностью достраивая соответствующий ген на всем его протяжении. А так как синтез начинался на каждой нити ДНК отдельно, то в результате получается две молекулы двухцепочечного ДНК. Другими словами, количество ДНК увеличивается в два раза.
8. Повторение циклов (от 30 до 80 раз) приводит к накоплению (амплификации) искомого гена.
9. На завершающем этапе определяют количество ДНК в реакционной смеси с помощью электрофореза. При положительной реакции оно резко возрастает, в случае отрицательного результата – не из-меняется. Полимеразная цепная реакция – сложная процедура, требующая квалифицированного персонала, комплекса оборудования и специальных расходных материалов. Для проведения реакции оборудуется специальное помещение, которое часто так и называется: лаборатория ПЦР.
Загрузка...