Крупные частицы, суспендированные в воде, оседают на дно под действием силы тяжести, если их плотность выше плотности растворителя. Однако хотя плотность биологических макромолекул намного выше плотности воды, они остаются во взвешенном состоянии в растворе сколь угодно долго, так как гравитационной силе в этом случае успешно противостоит тепловое движение (диффузия).
Задача 13. Сравните величины гравитационной (потенциальной) энергии макромолекулы с мол. массой 100 кДа (Eграв= mgh) между двумя точками, отстоящими друг от друга на h = 1 см, и тепловой энергии (Eтепл=kT) той же самой молекулы при 20оС.
Для усиления гравитационной составляющей скорости движения макромолекул применяют седиментацию с помощью ультрацентрифуги. Седиментация - это общий термин для обозначения движения в поле центробежной силы. Измерение движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определением скорости седиментации, в результате чего рассчитывается коэффициент седиментации, значение которого дает информацию о молекулярной массе и форме частицы. Когда создаются такие условия центрифугирования, при которых распределение частиц вдоль центрифужной пробирки не изменяется во времени, т.е. частицы достигли седиментационного равновесия, то этот метод равновесного ультрацентрифугирования дает сведения о молекулярной массе и плотности частиц.
При конструировании ультрацентрифуг - приборов, в которых исследуемый раствор вращается со скоростями вплоть до 70 тыс. оборо- тов/мин, было проявлено немало изобретательности (рис. 26). При обычно используемых скоростях трение между вращающимся ротором и воздухом может вызвать недопустимый разогрев ротора. Поэтому в камере, в которой вращается ротор, необходимо создать высокий вакуум. Чтобы избежать конвекционного перемешивания, температура исследуемого образца должна поддерживаться на постоянном уровне с довольно высокой точностью, а это может оказаться нелегкой задачей. Силы, которые развиваются внутри ротора, огромны, и случается, что при больших скоростях ротор разлетается на куски. Чтобы эти осколки не разлетелись, камеру с находящимся в ней ротором должны окружать толстые стальные защитные цилиндры. Крайне важно, чтобы ротор был механически сбалансирован. Допустим, что массы двух ячеек с веществом, расположенных симметрично относительно оси ротора, различаются на 1 мг. При 400 000 g возникшая за счет этого разность сил, действующих на ротор, составит 400 г. Это весьма ощутимая сила, которая приведет к вибрации ротора. Но, как ни важно уравновесить ячейки ротора, этого нельзя сделать идеально. Поэтому в любой ультрацентрифуге используется гибкий вал, чтобы ротор мог сам найти точное положение своего центра масс и вращаться вокруг оси, проходящей через этот центр. Это позволяет уравновешивать образцы с допуском 0.5г без нежелательных последствий. Коэффициент седиментации определяют измеряя с помощью специальной оптической системы скорость перераспределения макромолекул в центрифужной пробирке непосредственно в ходе ультрацентрифугирования. Хотя теоретически значение коэффициента седиментации при одной и той же температуре должно быть постоянным для частицы в данном растворителе, на практике для макромолекул s оказывается зависящим от концентрации макромолекул, скорости центрифугирования и ионной силы растворителя.
Как правило, наблюдается уменьшение наблюдаемой скорости седиментации с увеличением концентрации макромолекул, свя- занное с нелинейным увеличением вязкости раствора и с увлечением крупными макромолекулами за собой молекул растворителя и других более медленно седиментирующих молекул (эффект Джонстона-Огстона). Увеличение скорости центрифугирования приводит к увеличению измеряемого значения s и связано с тем, что при большой скорости крупная макромолекула оставляет после себя след (подобный кильватерной струе, образующейся при движении корабля), увеличивающий скорость движения макромолекул непосредственно позади нее. Часто такой процесс сопровождается агрегированием макромолекул и изменением их формы, что тоже приводит к увеличению s.
Поскольку макромолекулы заряжены, то при низкой ионной силе нейтрализующие ионы, седиментирующие медленнее, чем макромолекулы, отстают, и это приводит к воз- никновению тормозящего макромолекулы электрического поля. Это осложнение легко устраняется использованием избытка противоионов при высокой ионной силе. Измерив s20,w и D20,w, можно по уравнению Сведберга рассчитать молекулярную массу макромолекулы. Учтя все перечисленные выше зависимости, значение s для ДНК можно измерить с точностью до 2%, что приводит к получению значения M с ошибкой в 4%, а для белков s может быть измерен с точностью до 1%, что дает ошибку в определении M, равную примерно 1.5%. Если для макромолекулы известны s20,w, D20,w и M, то из уравнения Сведберга можно рассчитать ее vмол.
Гораздо более точно определять молекулярную массу макромолекул (ошибка не превышает 1%) позволяет метод седиментационного равновесия, заключающийся в том, что центрифугирование проводится при относительно низкой скорости, при которой седиментация макромолекул настолько медленна, что уравновешивается диффузией. В этом случае отпадает необходимость определения коэффициента диффузии, но для достижения равновесия обычно требуется не менее суток. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности растворителя является чрезвычайно эффективным методом разделения макромолекул. Здесь равновесие устанавливается в градиенте плотности тяжелой соли типа CsCl. Данная макромолекула в таком растворе либо всплывает, либо погружается, пока не достигнет изопикнической точки, в которой плотность рас творителя равна плавучей плотности макромолекулы (которая не совпадает с плотностью собственно макромолекул из-за сложных термодинамических эффектов). Если плотность раствора линейно изменяется на небольшом расстоянии, то макромолекулы с данной молекулярной массой оказываются в узкой зоне с центром в изопикнической точке и шириной, обратно пропорциональной корню квадратному из значения молекулярной массы. Большое достоинство этого метода состоит в том, что после разделения компонентов смеси макромолекул пробы раствора можно отбирать на разной всоте центрифужной пробирки и определять содержание в них исследуемых компонентов химически (и, следовательно, очень селективно).