В предыдущем разделе было показано, что для того чтобы получить информацию о размере и форме макромолекулы можно использовать коэффициент трения f между макромолекулой и молекулами растворителя. Проще всего для определения f использовать процесс диффузии, т.е. процесс перемещения молекул из области
с высокой концентрацией в область с низкой концентрацией этих молекул при отсутствии движущей силы (беспорядочное тепловое движение), для которого f = kT/D (уравнение Эйнштейна- Сазерленда), где k - константа Больцмана, T - абсолютная температура, а D – коэффициент диффузии.
Коэффициент диффузии макромолекул обычно измеряют путем создания границы между буфером и раствором макромолекул с известной концентрацией, наблюдая уширение этой границы во времени. Хотя это измерение выглядит очень простым, практическое его применение связано с большими экспериментальными трудностями.
Константы диффузии макромолекул имеют порядок от 10-7 до 10-6 см2/с, поэтому для получения измеряемого уширения требуется много часов. В течение всего этого времени система не должна испытывать никаких механических воздействий, а точный контроль температуры должен исключить термическую конвекцию. Если макромолекула заряжена, то наличие в растворе низкомолекулярных ионов, которые диффундируют быстрее, чем макромолекула, приводит к образованию градиента электрического потенциала, который начинает влиять на движение макромолекул. Отсюда следует, что измерение коэффициента диффузии надо проводить в изоэлектрической точке или в растворе с достаточно высокой ионной силой, чтобы нейтрализовать влияние возникающего электрического поля. Кроме того, поскольку теория диффузии основана на допущении о независимом движении молекул (т.е. они не должны взаимодействовать), необходима экстраполяция до безконечно большого разбавления.
Другой метод основан на измерении возникающего вследствие эффекта Доплера отличия частоты светового луча лазера от частоты рассеянного света, отраженного диффундирующими молекулами. Этот сдвиг частоты связан с D простой зависимостью и обеспечивает точность измерений до 1%. Однако метод не пригоден для определения D молекул с очень большой длиной цепи. В настоящее время нет удовлетворительных методов для измерения D больших несферических молекул, таких как ДНК, поскольку в этих случаях значение D очень мало.
Коэффициент диффузии молекулы должен быть функцией температуры, при которой проводятся измерения. Он зависит также от вязкости растворителя, а она в свою очередь также является функцией температуры. Вместо того чтобы иметь дело со всеми этими зависимостями, обычно приводят значения измеренных констант диффузии к той величине, которая была бы получена при 20оС в чистой воде: D20,w/D=(293/T)(hw,T/hw,20)(hp,T/hw,T), где D20,w - константа диффузии в чистой воде при 20oС, Т - абсолютная температура в опыте, hw,20 - вязкость чистой воды при температуре 20oС, hw,T - вязкость чистой воды при температуре Т, hp,T - вязкость исследуемого раствора при температуре Т.
В таблице 5 приведены характерные значения коэффициентов диффузии D20,w для веществ и частиц, молекулярные массы которых лежат в интервале от меньших, чем 100Да, до больших чем 107Да. Как видно из таблицы, значения коэффициентов диффузии лежат гораздо в более узком интервале, чем молекулярные массы. Для белков относительно легко определить их мол. массу и измерить коэффициент диффузии. Поскольку значения плотности безводних белков и степень их гидратации лежат довольно в узких пределах от 1.33 до 1.45 г/см3 и от 0.3 до 0.4 г Н2О на 1 г белка соответственно, то можно использовать их средние значения - 1.37 г/см3 (vмол = 1/1.37 = 0.73 см3/г) и 0.34 г Н2О /г белка - для оценки формы белковой молекулы с помощью фактора Перрена. Результаты некоторых таких расчетов показаны на рис. 25.
Задача 12. Для данного белка определили D20,w = 3.7710-7 см2/с и M = 30 кДа. Принимая удельный парциальный объем безводного белка равным 0.73 см3/г, рассчитайте а) rгидр для сферической молекулы белка; б) степень гидратации d такой сферической молекулы; в) отношение осей для гидратированной (d = 0.34) молекулы белка, имеющей форму вытянутого эллипсоида. hw,20 = 0.01 г7с-17см-1.