Методы гистологического исследования. Современная гистология имеет широкий арсенал разнообразных методов исследования. Все эти методы объединяет требование применения специального прибора - микроскопа, и поэтому все они микроскопическими методами.
Зависимости от состояния исследуемого объекта эти методы разделяют на гостиной (или Суправитальное), когда изучаются живые клетки, ткани, органы и даже целые организмы, и поствитальни, когда исследуют мертвые фиксированные объекты.
Становление поствитального метода, или метода изготовления постоянного гистологического препарата, происходило параллельно со становлением самой науки гистологии во второй половине XIX в. Его называют еще методом классической гистологии. Этот метод, называется гистологической или микроскопической техники, требует достаточно сложной подготовки объекта исследования. Последняя является предметом для написания специальных, достаточно больших по объему пособий. Студенту, который начинает изучать гистологию, необходимо ознакомиться с основами техники изготовления гистологических препаратов, для того чтобы лучше понять эти препараты и научиться анализировать, "читать", ибо именно постоянные гистологические препараты широко используются как в учебном процессе, так и в научных исследованиях.
Первый этап при изготовлении препарата - получение материала. Уже на этом этапе, как и на всех последующих, следует избегать излишнего травмирования объекта. Поэтому, вырезая кусочек органа или ткани, надо брать острые ножницы или лезвие, не сжимать ткань пинцетом. Кусочки берутся небольших размеров - около 1 см3 (лучше 7x7x3 мм). Материал должен быть свежим, принимать его нужно как можно скорее после забивки экспериментального животного или смерти человека.
Следующий этап - фиксация материала, осуществляется путем погружения взятого кусочка в фиксирующие жидкости. Целью этого этапа является закрепление гистологических структур и макромолекул в том месте и состоянии, в котором они были в живом объекте. Конечно фиксаторы обусловливают определенные изменения прижизненного состояния структур, но можно подбором специальных фиксировали-ных агентов свести эти изменения к минимуму. Фиксаторами служат спирты (этиловый, метиловый), растворы формалина, соли тяжелых металлов, кислоты (уксусная, пикриновая, осмиевая). Чаще применяются различные сложные фиксирующие смеси, включающие названные компоненты в различных соотношениях.
Третий этап - обезвоживание фиксированного материала. Для этого используют спирты различных концентраций, постепенно возрастают от 50-70 до 100 градусов. Обезвоживание необходимо для следующего этапа - уплотнение объекта, осуществляется в парафине, целоидини, синтетических смолах. Подавляющее большинство этих веществ с водой не смешивается, и поэтому для пропитки ими материала необходимо тщательно удалить воду из ткани, а затем пропитать ее ксилолом (толуолом, бензолом), то есть веществом, хорошо растворяет парафин, а также смешивается со 100-градусным этиловым спиртом . После пропитки объекта жидким парафином при температуре 55-5б ° С ему дают затверднуты при комнатной температуре вместе с парафином в специальных формочках. Так получают парафиновый блок. Эта процедура называется заливкой. Ускоренное уплотнение достигается путем замораживания кусочков ткани сухим льдом (двуокисью углерода) или жидким азотом, однако структура исследуемых гистологических объектов сохраняется в таком случае хуже.
Уплотнение материала позволяет изготовить из него тонкие (толщиной 5-7 мкм), пивтонки (0,5-1 мкм) срезы, используемые для световой микроскопии, для электронной микроскопии используют ультратонкие срезы (0,05-0,2 мкм). Изготовление срезов проводят на специальных приборах-микротомы (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии). Тонкий, пивтонкий или ультратонкий срезы являются прозрачными для световых лучей или пучка электронов объектами и дают возможность изучения их под соответствующими микроскопами. Для того, чтобы различать структурные детали объекта, большинство которых не имеют естественного контраста, полученный срез надо красить (для изучения под световым микроскопом) или контрастировать (для электронной микроскопии).
В гистологии существует много методов окраски препаратов и применяется много различных красителей зависимости от цели исследования. Гистологические красители по происхождению делятся на растительные, животные и синтетические (анилиновые). Примером растительных красителей является гематоксилин, получаемый из коры кампешевого дерева, растущего в Центральной Америке, а животных кармин, который получают из насекомых - кошенили. Абсолютное большинство красителей являются синтетическими - эозин, фуксин, азур т.д..
Важнейшей является классификация гистологических красителей по химическим свойствам, поскольку на ней основывается ряд понятий и терминов, которые будут встречаться на протяжении всего курса. Итак, по химическим свойствам гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. Свойства кислых красителей оговариваются группами-СООН,-HS03,-Н2Р03, это так называемые анионные красители. Кислые красители окрашивают цитоплазму клетки, их называют цитоплазматическими. Примером таких красителей могут быть эозин (дает ярко-розовый цвет), светлый зеленый (дает зеленый цвет). Гистологические структуры, способные закрашиваться кислыми красителями, называют оксифильных (ацидофильными, эозинофильными). Это, например, цитоплазматические гранулы эозинофильных лейкоцитов, коллагеновые волокна и т.п..
Основные красители являются катионными, подавляющее большинство их в составе молекулы должно положительно заряженные атомы азота. Названы красители избирательно окрашивают ядра клеток и поэтому их называют ядерными. Примером могут служить гематоксилин (красит в сине-фиолетовый цвет), кармин (в светло-красный), сафранин (темно-красный), азур II (в синий). Гистологические структуры, способные закрашиваться основными красителями, называют базофильными. Это гранулы в цитоплазме базофильных лейкоцитов, ядра клеток и т.п..
Нейтральные красители образуются в случае сообщения водных растворов кислого и основного красителей, например, еозиново-кислый метиленовый синий. Кроме того, следует различать нейтральные красящие смеси, когда в растворе одновременно имеются основной и кислый красители. Структуры, которые одновременно воспринимают и основные и кислые красители, называют нейтро профильной-ми, или полихроматофильнимы. Примером могут служить гранулы нейтро профильных лейкоцитов, цитоплазма полихроматофильних эритро-бластов т.д.. Способность гистологических структур менять цвет основного красителя обозначается термином метахромазии. Метахроматические окрашивается зернистость базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хрящевой ткани и т.д.. Препараты обычно красят, сочетая один кислый и один основной краситель, что позволяет выявить ядро, цитоплазму и все базофильные и оксифильные структуры. Одними из наиболее часто объединяемых красителей является гематоксилин и эозин.
Кроме кислых, основных и нейтральных красителей существуют специальные, используемые для выявления определенных веществ или структур. Например, судан III окрашивает жировые вещества в оранжевый цвет, а орсеином - эластичные волокна в бурый.
Крашеные препараты обычно обезвоживает в спиртах, просвещают в ксилоле и заливая тонким слоем канадского бальзама, накрывают покровным стеклом. После высыхания бальзама получают постоянный препарат, которым можно пользоваться в течение длительного времени. Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротомах, размещают на специальных сеточках, контрастируют солями урана или свинца, просматривают через микроскоп и фотографируют. Полученные микрофотографии являются объектом изучения одновременно с гистологическими препаратами.
Кроме описанных тонких срезов есть еще другие виды гистологических препаратов, которые используют значительно реже, лишь в отдельных случаях. К ним относятся мазки (крови, костного мозга, слюны и т.д.), отпечатки (печени, тимуса, слизистой оболочки мочевого пузыря), пленки (соединительной ткани, плевры, брюшины, мягкой мозговой оболочки), тотальные препараты (зародыши ранних стадий развития, половые клетки).
Гостиные (прижизненные) методы исследования клеток или тканей дают возможность получить информацию о том, как в них происходят процессы жизнедеятельности, проследить движение, разделение, рост, взаимодействие клеток, их реакцию на действие различных факторов. Прижизненные методы исследования - необходимое дополнение к тем данным, которые получены методом классической гистологии о строении клеток, тканей. Прижизненные исследования проводят в живом организме, то есть in vivo. Для исследования живых клеток используют методы поздравительное и Суправитальное окраску. Для этого применяют специальные, не токсичны для живых тканей, красители. При поздравительное окраски краситель вводят в организм живого животного и он избирательно окрашивает определенные клетки. Так исследуют клетки макрофагичнои системы при условии введения трипанового синего или литиевого кармина. Суправиталь-не окраска - это окраска живых клеток, изолированные из организма. Так обнаруживают лизосомы (краситель нейтральный красный), митохондрии (Янус зеленый), ретикулоциты крови (бриллиант-крезиловий синий).
Для поздравительного или Суправитальное, а также поствитального исследований неокрашенные гистологических объектов используют ряд специальных методов световой микроскопии - фазоконтрастну, темнопольову, флуоресцентную.
Метод фазового контраста обеспечивает необходимую контрастность исследуемых неокрашенные структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещается в конденсор, и так называемой фазовой пластинки, содержащейся в объективе. Такая конструкция оптики светового микроскопа позволяет преобразовывать фазовые изменения света, проходящего через объект, в амплитудные, которые замечает глаз как изменения яркости.