Достигнутые молекулярной биологии и генетической инженерии успехи последнее время во многом стали возможными благодаря применению сравнительно простых (а потому доступных широкому кругу
экспериментаторов), воспроизводимых и результативных методов, где в качестве объектов исследования широко используются бактерии, низшие грибы и бактериофаги. При этом микробные клетки и фаги размножаются in vitro на агаровой среде, образуя соответственно колонии и бляшки, которые представляют собой потомство одного человека (микробной клетки или вирусной частицы). Разработка методов, позволяющих получать и в дальнейшем поддерживать культуры клеток эукариотических многоклеточных организмов, в которых одноклеточный организм полностью сохраняет геном исходного вида и одновременно во многих отношениях ведет себя как микроорганизм, является своего рода фундаментом, на котором возводится строение клеточной инженерии и биотехнологии.
Одним из основных свойств клеточных культур является ограниченная продолжительность жизни даже при условии постоянного переноса их на свежий питательную среду (после 50-100 делений клеточные культуры погибают). Не является исключением и такие клетки, которые хорошо переносят культивирования - фибробласты. Чем меньше возраст источника, из которого получены клетки для культивирования в культуре, тем больше раз они способны делиться прежде чем погибнуть. Так, если донором является плод, то количество делений клеток, находящихся в культуре, достигает 50, однако только до 30 раз делящиеся клетки, взятые для культивирования у младенца.
Для объяснения старения и гибели клеток предложено несколько гипотез, одна из которых связывает старение с накоплением соматических мутаций, нарушением транскрипции и трансляции, биосинтеза значительного количества неактивных или частично активных молекул, что приводит к увеличению количества аномальных продуктов обмена. Однако приводятся данные о том, что вирусы в старой и молодой клеточной культурах размножаются одинаково успешно. В связи с этим высказывается мнение о том, что аппарат биосинтеза белка клетки-хозяина, участвующего в процессе репродукции вирусов, функционирует в старых культурах клеток так же хорошо, как и у молодых.
Гипотеза запрограммированной гибели клеток предусматривает, что смерть клеток - это результат реализации генетической программы. Имеющиеся экспериментальные данные подтверждают, что гибель клеток в культуре и организме наступает после количества делений, которые совпадают, и является следствием реализации генетической программы. Высказывается мнение, что одной из причин гибели клеток, в которых нарушено соотношение между скоростью деления и интенсивностью обмена, является накопление липофусцина, который вследствие распада белковых структур, липидов и гема. В клетках, делящихся накапливается липофусцин, который распределяется между дочерними клетками. Кроме того, вещества, входящие в состав липофусцинових гранул, используются повторно (Зенгбуш П., 1984). Процесса накопления липофусцина в гибели клеток отведена важная роль, но нет объяснения, почему столь долгую жизнь в культуре раковых клеток. Анеуплоидных (клетки, в которых число хромосом в ядрах не является кратным гаплоидному набора), а также много линий опухолевых клеток является исключением из этого правила.
С 1951 г. культивируется линия анеуплоидных (60-70 хромосом) опухолевых клеток, известных как клетки HeLa. Они были получены из опухолевой ткани умершего от рака матки негритянки. На сегодня эта культура клеток в условиях лабораторий по показателям роста превосходит другие линии, полученные впоследствии от больных раком людей белой расы. Фермент глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназа негров и людей с белой кожей при гель-електрофо-рези ведет себя неодинаково, что положено в основу маркировки клеток HeLa. Что касается растительных клеток, то имеющиеся данные к размножению черенками свидетельствуют о неограниченной способность клеток растений к делению.
Для поддержания функционально активного состояния клеток в культуре важной была разработка воспроизводимых условий культивирования, особенно необходимость стандартизации состава питательной среды. Так, в среду для культивирования фибробластов мыши вводили лошадиную сыворотку, экстракт из куриных эмбрионов и соли. Игол М.Г. (1955) предложил многокомпонентную смесь, известную как среда Игла (табл. 4.1). При длительном культивировании возрастают требования к буферных растворов. Предпочтение отдается глицилглициновому, трис-(гидроксиметил)-аминометановому и 4 - (2-гидроксиэтил)-1-піперазинетансульфокислотному (ГЕПЕС) буферам. Влияние сывороточного компонента среды Игла на функциональное состояние клеток в культуре тем эффективнее, чем меньше возраст животного, от которого эта сыворотка получена (лучше использовать сыворотку эмбрионов).
Для обеспечения стерильности, что является сверхжесткий контролируемой условием, последнее время практикуется использование стерильного пластмассовой посуды (флаконов, чашек, пипеток) одноразового использования. В связи с тем, что разделение некоторых типов клеток в культуре наступает лишь тогда, когда они прикреплены к субстрату, материал следует подвергать специальной обработке при подготовке к процедуре культивирования.
Растущие в культуре и прикреплены к субстрату клетки чаще сплющенные и имеют вытянутую веретенообразную форму; клетки, растущие в суспензии, имеют, как правило, сферическую форму.
Клеточную массу для культивирования получают путем трип-тической обработки соответствующего органа; последний распадается на отдельные клетки, с соблюдением всех ограничений, связанных с необходимостью соблюдения стерильности, переносят на питательную среду для культивирования. Единичные эукариотические клетки, которые не способны делиться, быстро погибают. Учитывая такую власти-ось при культивировании прибегают к созданию слоя питательных клеток, для чего предназначены для клонирования клетки наносят на слой клеток, утративших после облучения способность делиться, но еще на некоторое время сохранили метаболизм. Этого оказывается достаточно, чтобы нанесенные на этот слой клетки начали делиться. Однако количество клеток, вступивших в фазу деления, отнесена к количеству нанесенных на питательную среду всегда меньше 100%. При добавлении к питательной среде некоторых веществ-Мито-генов способность клеток к делению повышается. Среди митогенов различают группу веществ (факторы роста), содержащиеся в сыворотке крови в незначительных количествах, обладающие свойствами гормонов. Идентифицированы факторы роста нервов (ФРН), эпидермиса (ФРЭ), фибробластов (ФРФ) являются белковыми веществами, молекулярная масса которых колеблется от 6045 (ФРЭ) и 13,4 тыс. (ФРФ) до 130 тыс. (ФРГ). Спектр их действия гораздо шире, чем стимулирование митоза.
Помимо факторов роста, митогенного действием обладают вещества, называемые лектинами. их общим свойством является способность специфически связывать остатки сахаров. В зависимости от количества участков, с которыми вступают во взаимодействие сахара, различают двух-и поливалентные лектины. Основным источником лектинов являются бобовые (1,5-3% всех белков), хотя из бактерий, беспозвоночных (улитка) и позвоночных (электрический угорь) также выделены эти вещества. Из семян клещевины полученный рицин, из ландыша мечевидного - конканавалин А (Con A), из семян фасоли - фитогема-глютинин (ФГА). При насыщении моносахара среды, содержащей лектины, последние теряют способность взаимодействовать с ву-глеводовмиснимы рецепторами поверхности, так как специфические участки лектинов, с которыми могли бы вступить в реакцию углеводороды рецепторы клеточной стенки, занимают ранее добавлены моно-сахара. Клетки в культуре ведут себя по-разному. Одни (фибробласты) легко поддаются культивированию, другие (клетки эпителия, нейроны) делятся значительно труднее.
Определяющим параметром обращения клеток в культуре является так называемое контактное торможение, или регуляция клеточного роста, зависит от количества клеток на единице площади. Максимальная плотность, может быть доступна для нормальных клеток в культуре, достигает 104/см2 особей, количество раковых клеток на два порядка выше (106/см2). Кроме того, нормальные клетки, растущие на субстрате, представляют собой монослойный образования: рост клеток опухоли характеризуется безалаберностью, в связи с чем возникает многослойное образование. Высказывается мнение, что причиной торможения клеточного деления является выщелачивания микросреды. Митогены (вещества, стимулирующие клеточное деление) и халона (вещества, тормозящие процесс разделения) также выступают как регуляторы клеточного роста. Такие свойства клеток, как адгезия (сцепление клеток между собой и субстратом) и контактное торможение в значительной мере зависят от характера распределения на клеточной поверхности и подвижности в мембране углеводосодержащими рецепторных молекул. С помощью лек-заборов, способствующих агглютинации клеток, установлено, что рецепторы на поверхности опухолевых клеток распределены неравномерно (они образуют скопления). Распределение рецепторов на клеточной поверхности, их количественные и качественные характеристики в значительной степени приводят к тому, что адгезия и контактное торможение в раковых клетках проявляются слабее, а агглютинации под действием лектинов они подвергаются легче, чем нормальные дифференцированные клетки.