Причиной установленного еще в прошлом веке факта многоядерности клеток как патологических (опухоли, участки с воспалением, образующихся при коровьей оспы и др.)., Так и нормальных (мышечные волокна) тканей могло
быть, с одной стороны, разделение ядер без одновременного деления клеток (например, формирование плазмодия слизистого гриба Physarium), с другой-слияния нескольких клеток (миобластов) и образование многоядерной клетки - мышечного волокна. Слияние происходит не только среди дифференцированных клеток в многоклеточных организмах, но и между клетками в культуре. Сливаться могут клетки различного типа, принадлежащих к тому же виду (например, мышиные фибробласты и мышиные лимфобласты), так и клетки животных разных видов (например, мышь / человек; хомяк / курка; комар / человек). В первом случае родительские клетки, сливаются, различаются между собой по морфологическим, биохимическим, иммунологическим или функциональными свойствами, а продукты слияния является внутривидовыми гибридами. Во втором случае образуются межвидовые гибриды, а исходные родительские клетки, от слияния которых эти гибриды появляются, прежде всего отличаются генотипически, а иногда и фенотипически. Многоядерные клетки (поликарионы), образующихся в результате слияния клеток двух разных типов (А и В), представлены тремя комбинациями - АА, ВВ и АВ. Поликарионы, содержащих ядра только одного клеточного типа (АА и ВВ), называются Рэндзю-Риони; поликарионы, в составе которых присутствуют ядра обоих родительских типов (АВ), относятся к гетерокарионы. Слияние в гетерокарионы ядер после слияния клеток является результатом возникновения клеточного гибрида (рис. 4.1). Овчинников Ю.А. (1982) нашел решение проблемы с помощью метода гибридизации соматических клеток. Гибридизация широко используется в генетике, биологии клетки, биологии развития, вирусологии, биологии опухолей и других отраслях биологической науки, а также на практике.
Метод получения и культивирования гибридных клеток может быть использован для решения практических вопросов здравоохранения, потому что за продуктами экспрессии хромосомы остались в геноме синкариона из родительской клетки человека, определяются признаки генетических наследственных заболеваний. С помощью метода гибридизации соматических клеток удается ре-активировать онкогенный вирус. При слиянии клеток-вирусоносителей с нормальными, но чувствительными к опухолевого вируса клетками в синкарионах, образовавшиеся наступает реактивация вируса, интенсивно размножается в количествах, достаточных для его обнаружения.
Этот методический прием используют для выявления в опухолевых клетках онкогенного вируса. Образование синкарио-нов, последующее изучение клеточных гибридов в культуре, а также при введении их суспензии животным и появление опухолей наблюдается не во всех случаях, дает необходимую информацию для выяснения механизмов возникновения рака. Например, решать вопрос о злокачественности или доброкачественности полученного из опухолевой и нормальной клеток синкариона возможно, очевидно, в зависимости от наличия или отсутствия в гибридной клетке определенных хромосом.
Антисыворотки со специфическими антителами, полученными обычными методами, широко и успешно использовались для идентификации, очистки или для разрушения определенных клеток, находящихся в окружении клеточных популяций, которые различаются между собой. Специфические антисыворотки использовались при изучении клеточных линий и факторов, участвующих в процессах пролиферации и дифференциации, а также для идентификации компонентов синапсов, которые представляют собой места межклеточного взаимодействия в нервной системе.
С помощью методик с использованием антисыворотки была установлена специфическая локализация калмодулином, клатрину и тубулина в синаптических участках, что позволило сформулировать более обоснованное мнение о функции этих молекул, участвующих в обеспечении жизнедеятельности всех клеток. Кроме того, с помощью антисывороток в местах нервно-мышечного соединения были обнаружены специфические для данного участка антигены, которые играют важную роль в функционировании этого синапса. Становится очевидной потенциальная возможность метода применения анти-сывороток для раскрытия механизмов дифференциации нерва и мышцы в этой специализированной области.
Антисыворотки оказались наиболее эффективными реагентами, а их применение дало возможность выявлять локализацию клеток, синтезирующих и содержат нейропептиды и непептидного медиаторы, а также ферменты, участвующие в их биосинтезе. Высокая чувствительность имуноцитохимичних методов позволила идентифицировать и определить локализацию более двух десятков медиаторов.
Участие многих органических молекул в регуляции специфических клеточных функций удалось установить также с помощью иммунологических исследований. Потенциальные возможности метода невозможно реализовать через недостатки, присущие антисироват-кам, полученным в результате иммунизации животных гетерогенными имуногенамы. Эффективность антисывороток уменьшается из-за наличия не только молекул, которые интересуют в данный момент исследователя, но и других антигенов. Так, есть основания полагать, что отдельная клетка иммунной системы, синтезирующей иммуноглобулин (Ig), и ее потомки воспроизводят только один вид антител. Это уникальное свойство иммунной системы была положена в основу при разработке метода по снижению гетерогенности стандартных антисывороток. Иммунизацию животных проводят гетерогенными или полиспецифичнимы антигенами. Однако в дальнейшем в культуре выращивают клоны отдельных синтезирующих иммуноглобулин клеток, продуцирующих отдельные моноспецифических или моноклональные антитела, свободные от примесей антител к посторонним антигенов. Идентификация клеток, образующих антитела, не имеет особой сложности касающийся размножения их в культуре, то, как было сказано ранее, это удается сделать в течение непродолжительного времени. Гибридные клетки, полученные слиянием опухолевых и секретируют-чих иммуноглобулин клеток иммунной системы - гибридомы, сочетают в себе способность к длительному размножению в культуре со способностью биосинтеза моноклональных антител. Впервые Гибро-дома были получены путем слияния антителообразующих клеток селезенки (спленоцитив) мыши, иммунизированного бараньими эритроцитами, с миеломной клеткой, у которых отсутствовала гіпоксантинфосфорибозилтрансфераза (фермент, участвующий в реакциях метаболизма пуринов). Чтобы увеличить вероятность слияния родительских клеток и повысить выход гибридом, как вспомогательное средство используют вирусы с агглютинирующие свойствами. Вирусные частицы накапливаются на поверхности родительских клеток, которые вступают в контакт, на поверхности контактирующих клеток появляется большое количество микроворсинок, что в местах соприкосновения сливаются, образуя цитоплазматические мостики. Зоны слияния постепенно расширяются, заполняя всю площадь мембраны в области клеточного контакта.
Köhler G., Milstein C. (1975), что первыми предложили способ получения гибридом, для слияния родительских клеток использовали вирус Сендай, который относится к группе вирусов па-рагрипу, инактивированного ультрафиолетовым излучением. Вместо вирусов используются липиды, ионы кальция в щелочном растворе (рН 10,5), фосфолипаза С. В последнее время нашел широкое применение полиэтиленгликоль. Такие вещества, как цитохалазином В, ингибиторы энергетического обмена, а также средства, вызывающие местную анестезию, наоборот, блокируют процесс слияния клеток.
Клетки селезенки, не приняли участия в образовании гибридом, через некоторое время погибали, потому что не были способны к пролиферации и выживания в культуре. Миеломные клетки, оставшиеся в культуре, под влиянием приложенного в среду Аминоптерин погибали, так как процесс синтеза пуринов de novo прекращался. Ги бридомни клеточные линии были жизнеспособными в культуре благодаря присутствию гена, кодирующего биосинтез фермента гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы, при участии которого гипоксантин превращается в пуриновые нуклеотиды. Гены родительской миеломы обеспечивают гибридомной культуре постоянный раздел.
Линия гибридомных клеток, синтезирует антитела против бараньих эритроцитов, была идентифицирована методом их гемолиза. Кроме того, оказалось, что в популяции гибридомных клеток количество клонов, продуцирующих антитела против бараньих эритроцитов, в 100 раз превышало количество клонов в исходной родительской популяции спленоцитив (10% в гибридомных популяции против 0,01% в популяции спленоцитив). Этот пример указывает на способность стимулированных антигеном клеток обеспечивать получение функционально активных гибридов.
При гибридомной технологии подходящей является такая система отбора, при которой жизнедеятельном оставались только гетерокарионы. С этой целью подбираются исходные родительские клеточные линии, имеющие дефекты в генах, которые препятствуют их деления и роста. Одновременно вследствие взаимной комплементации гетерокарионы сохраняют способность к делению (Зенгбуш П.).
Наиболее распространенной является система отбора с помощью селективного среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАО). Исходные родительские клеточные линии, используемые для получения клеточных гибридов, содержащих дефектные ферменты; гіпоксантингуанозинфосфорибозилтрансферазу (ГГФРТ), резистентной к 8-азагуанину (АГ), или тимидинкиназу (ТК), резистентной к 5-бромдезоксиуридину (БГУ). Исходные родительские клетки не могут расти в среде, содержащей гипоксантин - превращен пурин, тимидин - превращен пиримидин и аминоптерин (среда ГАО). Аминоптерин блокирует синтез гипоксантина и тимидина, а в отсутствие фермента ГГФРТ и (или) ТК клетки не могут использовать эти вещества, содержащиеся в среде. Из исходных линий родительских клеток, находящихся в среде ГАО, резистентных к АГ (ГГФРТ / ТК +) и резистентных к БГУ (ТК / ГГФРТ +), способность к делению будут сохранять клеточные гибриды, образованные в результате слияния исходных клеточных линий. Линии ГГФРТ-и ТК-уже получены для мышей, крыс, золотистого и китайского хомяков, а также для человека. По методике, аналогичной описанной, с использованием полиэтиленгликоля вместо вируса Сендай для индуцирования процесса слияния родительских клеток полученные антитела для большого количества антигенов. На количество в селезенке В-лимфоцитов, взаимодействующих с определенным антигеном, влияет длительность интервала между последним иммунизацией животного и моментом взятия спленоцитив. Последнее обстоятельство влияет на чистоту образования гибридом, синтезирующих соответствующие антитела. Кроме описанных, есть данные о возможности получения гибридом путем слияния с миеломной клеткой селезеночных клеток, иммунизированных антигенами in vitro. Количество антигена для получения иммунного ответа в этом случае значительно уменьшается. Для преобразования линии клеток, которые секретируют антитела, нет необходимости проводить их гибридизацию с миеломной клеткой. С помощью вируса Эпштейна-Барра возможна прямая трансформация клеток, которые секретируют антитела, специфичные к дифтерийного и столбнячного токсинов. Длительное поддержание в функционально активном состоянии клеточной культуры Т-лимфоцитов с помощью дополнительных ростовых факторов свидетельствует о том, что в недалеком будущем можно будет получать непрерывно клоны В-лимфоцитов, способных к непрерывному делению.
Как отмечает Овчинников Ю.А. (1982), гибриды является только одним из вариантов использования культуры клеток в биотехнологии. С помощью гибридомной биотехнологии возможна регуляция иммунного ответа за счет получения моноклональных антител заданной специфичности.
Моноклональные антитела являются тем видом биотехнологической продукции, которую с успехом используют как в научно-исследовательской работе, так и для удовлетворения потребностей производства. Монокль-нальные антитела применяются при проведении идентификации молекул, интересующих исследователя, для очистки нужных антигенов (для детального анализа их структуры и функций), для выяснения механизмов дифференциации клеток в онтогенезе и разделения различных типов клеток иммунной системы. Моноклональные антитела, секретируемые культурой гибридомных клеток, является высокоэффективным и высокочувствительным диагностическим препаратом. Они могут использоваться как профилактические и лечебные средства, а также для получения Иммуносорбент, ферментных препаратов, интерферонов, гормонов и других биологически активных веществ (можно использовать культуры животных и растительных клеток).