Большинство исследований, выполненных в последние годы гибридизации соматических клеток эукариотических организмов (преимущественно млекопитающих) в клеточной культуре, убедительно доказали, что в гибридной
клетке, которые имеет смешанный геном в связи с гетерогенной природой родительских клеток, происходят стабильные изменения в экспрессии генов синкариона сравнению с процессом экспрессии в исходных родительских клетках. Так, при слиянии клеток крысиной гепатомы, синтезирующий и экскретируется альбумин, с мышиными фибробластами, не секретируют этот белок, были получены гибридные клетки, часть клонов которых синтезировали альбумин только крысы, только мыши или альбумины обоих исходных родителей (крысы и мыши ).
На основании результатов этого и других подобных экспериментов по гибридизации соматических клеток было высказано предположение о том, что в клетках млекопитающих есть вещества, способные прямо или косвенно влиять на клеточное ядро, изменять его функциональное состояние с помощью положительной или отрицательной регуляции экспрессии определенной части генов. Однако комплекс объективных причин (гетерогенность генома зачастую со значительным дефицитом хромосом, а также с хромосомными перестройками, произошедших которые находятся в окружении гетерогенной цитоплазмы), присущих метода гибридизации соматических клеток, не позволил идентифицировать вещества, участвующие в экспрессии генома, а также установить их химическое строение и механизм действия. До сих пор ученые располагали данными о том, что вещества, содержащиеся в цитоплазме животных, участвуют в регуляции экспрессии генов клеточного ядра.
Оказалось, что в ядрах предварительно изъятых из дифференцированной клетки и помещенных в цитоплазму яйцеклетки начинались процессы клеточной дифференцировки и во многих случаях развивался нормальный организм, то есть ядра специализированных клеток содержали полный объем необходимой для развития полноценного организма информации. Так, слияния ядер, удаленных из клеток кишечного эпителия головастика, с лишенной ядра яйцеклеткой во многих случаях приводило к развитию лягушки. Эти эксперименты, выполненные на амфибиях, показали, что цитоплазма регулирует активность ядра в специализированных клетках много функций ядра тормозятся компонентами цитоплазмы. Ингибирующее влияние, идущего к ядру со стороны цитоплазмы дифференцированной клетки, оказавшись в пригодном по химическому составу цитоплазматической окружении (яйцеклетка), устраняется, и в ядрах могут снова проходить процессы, определяющие клеточную дифференциацию (Gurdan JB, 1977). Эксперименты по трансплантации ядер были проведены на амфибиях. В разработке методов пересадки клеточных ядер млекопитающих существенную роль сыграло использование цитохалазином - веществ, синтезированных грибами. Высказывается мнение, что цитохалазином В, разрушая структуру микрофиламентов, способствует уникальному расположению ядра, когда оно остается подключенным к клеткой тонкой стебельком цитоплазмы. При центрифугировании в большинстве таких клеток разрывается «пуповина» стебельки и образуются Ену-клеевой (безъядерные) клетки (цитопласты) ядра, отделившихся при центрифугировании (кариопласты, или мини-кли-тины), окруженные тонким слоем цитоплазмы и плазматической мембраной .
Эффективность энуклеации контролировали, окрашивая (например, по методу Гимза) клеточный монослой, находящегося на поверхности одной из чашек или дисков. Следующая операция, направленная на получение популяции ци-топластив, - отделение их от целых клеток, оставшихся потому что в некоторых случаях (линия клеток мышиной гепатомы Hepa-2) эффективность энуклеации не превышает 50%. С этой целью, Ену-клеевой (цитопласты) и целые клетки, содержащиеся на поверхности пластиковых чашек и стеклянных дисков, снимали, обрабатывали трипсином, в результате чего в 1 мл солевого раствора с фосфатным буфером содержалось 106 целых клеток и цитопластив. Клеток-но-цитопластичну смесь нашаровувалы на 14 мл линейного градиента ренографину-76, который находился в центрифужные пробирке, объемная концентрация которого изменялась от 15 до 30%, и центрифугировали при 1000 g и температуре 25 ° С в течение 5 мин. Четко разграничены слои целых клеток и цитопластив удаляли из центрифужные пробирки и использовали по назначению.
Полученные в градиенте плотности ренографину-76 цитопласты не окрашивались трипановым синим, что послужило контролем эффективности разделения. Они сохраняли способность снова прикрепляться к поверхности культуральной чашки и могли использоваться в дальнейшем для реконструкции жизнеспособных клеток путем слияния с гетерологичных кариопласты.
Методы энуклеации, применены для получения кариопла-стов, отличаются от тех приемов, обеспечивающих успех при получении цитопластив. Клетки, предназначенные для выделения ка-риопластив, за 2 дня до энуклеации высевают на вырезанные из культу-ральных флаконов пластиковые пластинки, перед помещением в 50-миллилитровых центрифужную пробирку, заполненную обычным питательной средой, составляли так, чтобы их поверхности с прикрепленными клетками находились снаружи. Мышиные фибробласт-ни линии А9 центрифугировали при 9,5 тыс. g и 35 ° С в течение 15 мин. Назначение этой процедуры сводилось к тому, чтобы в осадке ка-риопластив, который должен быть получен, уменьшить количество целых клеток. После отделения слабо прикрепленных к субстрату клеток, пластинки с клетками монослоя, оставшиеся переносили в пробирки, где концентрация цитохалазином В из расчета на 1 мл обычного питательной среды достигает 10 мкг. Содержимое пробирок инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин, продолжительность центрифугирования при 35 оС и 7 тыс. об. / Мин - 45 мин. Надосадочную жидкость, образовавшуюся сливали, а осадок, представлен в основном кариопласты, ресуспендувалы в обычном питательной среде.
В изготовленных по описанной методике препаратах Кари-пластов находятся фрагменты цитоплазмы, кариопласты, погибших, и целые клетки. Отделение фрагментов цитоплазмы проводится осаждением в градиенте фиколау 1-6% концентрации при 1 g и 37 ° С в течение 90 мин в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Фрагменты цитоплазмы, находящихся в верхнем слое, отсасывают и удаляют, а осадок кариопласты, образовавшийся после удаления и разведение питательной средой, снова осаждают центрифугированием и ресуспендують в свежем питательной среде. Целые клетки (их 0,4-4%) удаляют путем двукратного 90-минутного инкубирования суспензии кариопласты в культуральных чашках.
Инкубирования в течение 3 часов позволяет резко уменьшить загрязнение кариопласты целыми клетками, обязательно для всех экспериментов с трансплантацией ядер.
Следующая операция - отделение жизнеспособных Кари-пластов от тех, которые погибли. Она включает ресуспендирования осадка в питательной среде до концентрации 107 мини-клеток в 1 мл, наслоения суспензии на Ficoll-paque (раствор содержит 5% фиколу и 9% диатризоату натрия), находящийся в центры-фужних пробирках, и осторожное добавление свыше 1 мл среды так, чтобы добавлено среду и суспензия кариопласты образовали два самостоятельных слоя. Следующее центрифугирования при 800 об. / Мин (130 g) в течение 75 мин при комнатной температуре позволяет получить осадок на 99% состоит из погибших кариопласты, на границе питательной среды и Ficoll-paque находится слой, состоящий на 98% из жизнеспособных Карио -пластов.
Для очистки кариопласты используют и другие методы, в частности доли тантала размером 1-3 мкм. Ко времени энуклеации практически все клетки содержат более по 12 частиц тантала. В связи с тем, что плотность тантала более чем в 15 раз превосходит плотность клетки, компоненты, содержащих частицы тантала, осаждаются значительно быстрее кариопласты, в которых тантал отсутствует. Очистка кариопласты иногда осуществляется с помощью цитофлуориметра-сортер. Свойства цитопластив и кариопласты. Установлено способность цитопластив синтезировать белки, поддерживать репликацию вируса везикулярного стоматита и полиовируса, синтез РНК и белка, контролируемый вирусом бешенства, увольнять вирус SV40
13 трансформированных клеток. Цитопласты содержат все виды органелл, свойственные нормальной клетке, сохраняют характерную для целых клеток способность прикрепляться к субстрату и образовывать складчатую мембрану, передвигаться и совершать пиноцитоз.
Вокруг кариопласты находится слой, на долю которого приходится около 10% клеточной цитоплазмы, содержащий компоненты эндоплазматического ретикулума, некоторое количество Мито-хондры и рибосом; центриоли в кариопласты, в отличие от цито-пластов, отсутствуют.
Около 10% кариопласты некоторых клеточных линий способны восстанавливать весь объем потерянной при энуклеации цитоплазмы и снова превращаться в жизнеспособные клетки.
Способность кариопласты регенерировать утраченную в процессе энуклеации цитоплазму и формировать жизнеспособные колонии клеток зависит от количества цитоплазмы, окружающей ядро. Во фракции кариопласты, у ядер которых сосредоточено 2-4% того количества цитоплазмы, содержащейся в интактной клетке (мелкие кариопла-сти), только один из 106 очищенных элементов может сформировать жизнеспособную колонию клеток.