После энуклеации клеток монослой цитопластов в пластиковых чашках диаметром 60 мм или стеклянных дисках диаметром 14 мм инкубируют в питательной среде при 37 ° С в течение 1-2 часов, а потом - 20 мин и охлаждают
до 4 оС. При этой температуре монослой дважды отмывают раствором Эрла (рН 8,0), затем 20 мин. обрабатывают 0,5 мл охлажденного раствора Эрла с вирусом Сендай, инактивированным облучением в течение 5 мин (ультрафиолетовой лампой на расстоянии 15 см), после чего слой цитопластив снова дважды промывают тем же раствором, который затем удаляют.
Кариопласты, взвешенные в солевом растворе на фосфатном буфере, добавляют к монослойный культуры цитопластив с таким расчетом, чтобы на один цитопласт приходилось 100 ка-риопластив. Для адсорбування кариопласты на цитопластах, покрытых вирусными частицами, инкубируют при 4 ° С в течение 45 мин, через каждые 3-5 мин чашки слегка покачивают. Для слияния Кари-пластов и цитопластив чашки или стеклянные диски переносят в термостат и выдерживают там при 37 ° С в течение 45 мин. По истечении этого времени монослой на чашках несколько раз интенсивно отмывают раствором Эрла или питательной средой без сыворотки, чтобы удалить кариопласты, не слились. Затем в чашки наливают питательную среду, пригодную для культивирования того типа клеток, которые были использованы как доноры Кари-пластов. Цитопласты, не слились с ядрами, погибают и через 2 дня видокремлються от поверхности чашки.
Для получения незагрязненных цитопластамы культур рекомендуется центрифугирования гибридных клеток в градиенте плотности ренографину.
Использование полиэтиленгликоля для стимулирования процесса слияния кариопласты и цитопластив при конструировании клеточных гибридов ограничено из-за его токсичности, что значительно превышает токсичность вируса Сендай.
Для идентификации гибридных клеток, определения эффективности трансплантации ядер и наличия родительских клеток в гибридной популяции используют мутантные клеточные линии.
Эффективность реконструкции клеток за счет слияния кариопласты и цитопластив зависит от многих факторов. Так, только около 10% цитопластив, полученных путем энуклеации клеток крысы линии НТС, сливались с кариопласты, выделенными из клеток мыши линии А9. Когда гибридизации подвергали цитопла-сти, полученные из фибробластов куриных эмбрионов, и кариопласты, представлявших находящиеся в покое ядра эритроцитов, эффективность реконструкции превышала 90%. Высокая эффективность слияния изолированных находящихся в покое ядер эритроцитов птиц с енуклейованимы цитопластамы, а также опыт активации ядер эритроцитов птиц, в частности кур, путем слияния этих эритроцитов с клетками HeLa или с другими клетками, имеющими активный метаболизм, позволили исследовать роль ядерно-цитоплазматических взаимодействий в экспрессии генов гибридных эукариотических клеток. Оказалось, что не все гибриды, образовавшиеся были жизнеспособными. Примерно 9% реконструированных клеток могут расти и делиться (Хайтауэр М., Льюкас Дж., 1985). В гибридных клетках сразу после слияния начинаются морфологические изменения. Через несколько дней реконструированы гибридные клетки почти не отличаются от исходных родительских, которые были использованы как доноры ядер.