Успехи молекулярной биологии, генетической и клеточной инженерии позволили уже сегодня решать вопрос направленной трансформации эукариотических организмов, в том числе млекопитающих.
Стратегическая цель направленной трансформации: конструирование геномов высших организмов (растений и животных). Одним из приемов генетической и клеточной инженерии является введение генов в половые клетки. Результате трансформации половых клеток происходят фенотипические изменения трансформанта на уровне всего организма, а также передача генетической информации, которая приобрела изменения, от родителей к потомкам.
Серов О.Л. приводит данные об обнаружении донорского генетического материала в организме, развившийся из трансформированных половых клеток, обращения трансгенов и прежде экспрессию донорского гена в ходе развития реципиентнои клетки (половой), изменения фенотипа, в том числе и на уровне целого организма, что обусловлено присутствием в геноме реципиента трансформанта (донорского генетического материала).
Гордон Д.В. с сотрудниками (1980) впервые успешно трансформировали оплодотворенную яйцеклетку мыши клонированным геном ТК вируса герпеса.
Для ввода донорского генетического материала использовали реципиентни яйцеклетки в течение 12-14 ч в начале оплодотворения. Яйцеклетки, находящиеся в настоящее время на стадии двух пронуклеусов, изымали из яйцевода вымыванием. По донорский материал служили рекомбинантные ДНК, сконструированные на основе плазмид (рSТ6, рSТ12, рSТ9 и др.)., В состав которых входил ген ТК вируса герпеса, кодирующий тимидинкиназу и тот участок вируса SV40, который содержит нуклеотидные последовательности, несущие на синтезированной иРНК сигналы начала репликации, и нуклеотидные последовательности, является промотором ранних белков.
Следующий этап трансформации - введение в пронуклеус оплодотворенной реципиентнои яйцеклетки с помощью микроиглы и микроманипулятора 1 мкл раствора рекомбинантной ДНК. Как указывает Серов О.Л., из обработанных таким образом яйцеклеток только 6-10% способны к дальнейшему развитию, а из этого количества примерно половина достигает зрелого возраста. Анализ рестрикционного спектра ДНК родившихся с трансформированных яйцеклеток мышат позволил сделать вывод о том, что плазмиды могут выполнять векторную функцию при введении клонированных генов в половые клетки, а из трансформированных яйцеклеток развиваються особи течение внутриутробного и постнатального онтогенеза сохраняют донорский генетический материал.
Позже была показана возможность трансформации оплодотворенных яйцеклеток с помощью микроинъекций клонированных генов ß-глобина человека и вируса герпеса, кодирующий тимидинкиназу (ТК). В этом случае экспериментаторы вводили в оплодотворенную яйцеклетку около 2,5 тыс. копий плазмид Ptk ^ ßl, в состав рекомбинантной молекулы ДНК которой входил фрагмент из 7,9 тыс. нуклеотидных пар, кодирующий ß-глобин человека (ген ß-глобина человека) , и фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность с 3,6 тыс. пар нуклеотидов, кодирующей ТК вируса герпеса.
В полученных из оплодотворенных трансформированных яйцеклеток ген ß-глобина человека находился в количестве 3-50 копий, а ген, кодирующий тимидинкиназу вируса герпеса - в количестве 3-20 копий. Кроме того, выявление донорского генетического материала (ген ТК вируса герпеса) в составе фракции высокомолекулярного ДНК, выделенной из клеток реципиентного организма, дает основания считать, что донорский генетический материал был интегрирован в геном реципиента. В опытных мышей, полученных из иньекцийо-ванных чужеродным генетическим материалом (плазмида Ptteßl, гены ТК вируса герпеса и ген ß-глобина человека) оплодотворенных яйцеклеток, четко проявлялся также ген ß-глобина человека.
В ходе этих экспериментов был установлен факт передачи донорского генетического материала, найденного в клетках селезенки мышей, развившихся из трансформированных чужеродных ДНК яйцеклеток в организм потомства, полученного при спаривании трансформантов с нормальными мышами. Очень важным моментом следует считать выявление функциональной активности чужеродных генов, находящихся в организме трансформантов, что проявляется прежде экспрессией этих генов.
Прямой путь введения клонированных генов в эмбрионы, находящиеся на ранних стадиях развития, без использования вирусных или плазмидных векторов дал положительные результаты. Донорские гены в функционально активном состоянии (они експресува-лись) были обнаружены в соматических клетках, полученных из оплодотворенных яйцеклеток после их трансформации фрагментом ДНК, кодирующий ген кроличьего ß-глобина. При трансформации оплодотворенных яйцеклеток или эмбрионов на ранних стадиях развития чужеродным генетическим материалом в составе плазмид-ных векторов или без них, далеко не все клетки растительного или животного организма-трансформанта, которые развились из трансформированной оплодотворенной яйцеклетки или эмбриона, содержащих чужеродный ген. Существует такая вероятность, что чужеродный ген окажется не только в соматических, но и в некоторых половых клетках организма или особей, развившиеся из трансформированной оплодотворенной яйцеклетки или трансформированного на ранней стадии развития эмбриона. Присутствие фрагментов чужеродной ДНК, представляет нуклеотидную последовательность того или иного гена, в половых клетках часто приводит к тому, что некоторая часть потомства, полученного от определенного лица, унаследует вместе с другими генами родителей внесен чужеродный гетерологичных ген. В таком случае этот ген уже будет присутствовать во всех клетках, в том числе и в половых, а следовательно, передаваться следующим поколениям и в случае проявления его функциональной активности обусловливать фенотипические изменения организма. Анализ результатов исследований позволил Серову А.Л. сделать вывод о том, что наиболее узким местом при трансформации половых клеток является экспрессия гетерологичных генов в трансформантов. В связи с этим предлагается конструирования таких векторов ре-комбинантних ДНК, в состав которых, кроме клонированных чужеродных генов, входили бы нуклеотидные последовательности, которые осуществляют регуляцию генной активности. Для достижения этой цели проводятся исследования с включением в рекомбинантные ДНК, наряду с чужеродными клонированными генами, промоторных участков вирусов, которые адаптированы к жизнедеятельности в клетках еукариотич-ных организмов и имеют тесную структурную взаимосвязь с их геномами. При конструировании способного к экспрессии репликон в составе вектора предлагается использовать промоторные и другие регуляторные последовательности ДНК высших организмов.
В подтверждение приводится пример создания рекомбинантной кольцевой молекулы, сконструированной с использованием генетического материала плазмид и фагов, в которой успешная экспрессия клонированного гена в трансформант достигалась за счет встраивания по ходу транскрипции перед клонированным геном нуклеотидной последовательности вируса SV40, содержащий сигнал начала репликации и промоторные нуклеотидные последовательности ранних или поздних белков. Предлагается как промоторы чужеродных клонированных донорских генов использовать конечные последовательности ДНК вирусов. Есть положительные примеры экспрессии чужеродных генов (ген ТК вируса герпеса), промоторные участок которых промотором гена МТ1 мыши (ген МТ1 кодирует белковые вещества металотионеину, синтез которого индуцируется ртутью, кадмием и другими тяжелыми металлами). В клетках печени и почках мышиного потомства, развившееся из оплодотворенных яйцеклеток, трансформированных рекомбинантными ДНК, в состав которых входили плазмиды РМК и ген ТК вируса герпеса, с которым по ходу транскрипции соединен промотор гена МТ1 мыши, проявляли высокую активность фермента тимидинкиназы вируса герпеса . Этот факт свидетельствует о экспрессию гена ТК вируса герпеса с участием промотора гена МТ1 мыши, т.е. промотора эукариотического гена. Экспрессия прокариотических гена ТК вируса была установлена не только у потомства, родившегося с трансформированной оплодотворенной яйцеклетки, но и у отдельных особей из потомства, полученного при спаривании трансформированных мышей с интактными животными. При этом функциональное состояние клонированного гена, кодирующего тимидинкиназу вируса герпеса, иньекцийованого в оплодотворенную яйцеклетку мыши в виде рекомбинантной ДНК, сконструированной на основе плазмиды РМК, и промоторные участки эукариотического гена МТ1 мыши, определяется регуляторной участком промотора гена МТ1 мыши: соли кадмия стимулируют экспрессию гена ТК вируса герпеса, а метилирования про-моторной участка (гена МТ1 мыши), наоборот, тормозит этот процесс.
Усилиями (Палмитер Р.Д. и др.., 1982, 1983, Дыбан А.П., Городецкий С.И., 1983) были сконструированы рекомбинантные ДНК, состоящие из клонированных генов гормона роста крысы и человека, промоторные участки гена МТ1 мыши и плазмидного вектора. Введены в реципиентни оплодотворенные яйцеклетки путем микроинъекций в пронуклеус рекомбинантные ДНК проявляли свою физиологическую активность как у мышей-трансформантов, так и их потомков.
Клонированный донорский ген гормона роста крысы и человека експресувався в печеночной ткани трансформантов, что означало повышение содержания гормона роста в сыворотке крови, а также по физиологическому действию дополнительных генов соматотропного гормона, которые передаются по наследству, что проявлялось ускоренным ростом трансформированных мышей и превышением средней массы тела животных в 1,8 раза. Это очень важно для животноводства.