При изучении процесса трансформации соматических и половых клеток Серов О.Л. чаще всего использовал клонированный ген ТК вируса герпеса (Herpes simplex), для чего обрабатывал геномной ДНК вируса
рестрикционным эндонуклеаза-ми Hpal и BamHI. Полученные в результате ферментативного гидролиза фрагменты ДНК, содержащие 8,3 тыс. и 3,4 тыс. пар нуклеотидных последовательностей, включают ген ТК; иРНК, образуется при транскрипции интактного гена ТК вируса герпеса, представляет собой последовательность, состоящую почти с 1,3 тыс. остатков нуклеотидов. Кроме того, было установлено, что при биосинтезе фермента тимидинкиназы 107-нуклеотидной участок, начиная от 51-конца, иРНК не транслируется. Фрагменты геномной ДНК вируса герпеса, включающих ген ТК, клонируют, используя как вектор плазмиды и фаги.
Трансформацию соматических и половых клеток геном ТК осуществляют с помощью рекомбинантных ДНК, сконструированных путем встраивания фрагментов ДНК вируса герпеса, содержащие ген, кодирующий тимидинкиназу. Чтобы увеличить эффективность трансформации, соматические или половые клетки обрабатывают очищенными или клонированными генами путем осаждения донорской ДНК кальций-фосфатным методом. В этом случае удается добиться введения очищенного или клонированного гена в одну из каждых 105-107 обработанных реципиентных клеток.
Более эффективным по сравнению с описанным методом переноса генов является введение микроиглой ДНК, находящейся в растворе, в ядра реципиентных клеток. В этом случае трансформируется 50-100% обработанных клеток. Такая же частота трансформации достигается и в том случае, когда ядро только прокалывается микроиглой. ДНК, представляющий очищенный или клонированный ген, в этом случае не вводится непосредственно в ядро, а используется для обработки клеток млекопитающих, находящихся в культуре. Из других методов, с помощью которых переносятся клонированные или очищенные гены в соматические реципиентни клетки млекопитающих, следует указать на возможность обработки реципиентных клеток включенными в липосомы препаратами ДНК или высокими концентрациями полиэтиленгликоля; в последнем случае удается добиться частоты трансформации, сопоставимой с показателем, достигнутым при применении метода микроиньекции раствора ДНК в ядро реципиентнои клетки.
Стоит также обратить внимание на метод котрансформации, который получает широкое распространение при введении в реципи-ентни клетки инородных неселектованих генов или фрагментов ДНК. Разрабатывается также способ трансформации реципиентних клеток с помощью электрического разряда в поле высокого напряжения.
Если при трансформации как донорский используется очищенный или клонированный ген, кодирующий тимидинкиназу, то Реция-пиентнимы является мутантные клетки, которые находятся в культуре, в геноме которых отсутствовал ген ТК, а для разделения трансформированных и нетрансформованых клеток используют селективное среду ГАО (рис. 4.3 ). Трансформированные геном ТК реципиентни клетки способны расти на среде ГАО, нетрансформовани - погибают. Существенное влияние на частоту переноса клонированного гена ТК вируса герпеса в эукариотические реципиентни клетки оказывает наличие или отсутствие ДНК-носителя. Трансформация клонов-ным геном ТК вируса герпеса реципиентных клеток китайского хомячка без ДНК-носителя оказалась более чем в 200 раз ниже по сравнению с опытами, в которых клонированный ген ТК вируса герпеса в реципиентне клетки переносили с участием ДНК-носителя. клонированного или очищенного гена, переносимая, от деградирующего влияния гидролитических ферментов реципиентних клеток. Успех введения очищенных или клонированных генов в соматические клетки с помощью кальций-фосфатного метода в значительной мере зависит от концентрации донорской ДНК. Хотя многие механизмов участия ДНК-носителя в обеспечении успеха трансформации Реция-пиентних клеток очищенным или клонированным генетическим материалом, а также роль ДНК-носителя в формировании трансгенома остаются невыясненными, факт изменения структуры очищенных или клонированных генов, введенных в реципиентни клетки в присутствии ДНК -носителя, считается установленным. Установленным, вероятно, следует считать также то, что структурные изменения экзогенного клон-ного генетического материала при формировании трансгенома наблюдаются лишь в том случае, если одновременно в реципиент-на клетку поступает ДНК-носитель. Роль последнего состоит в том, что структурные изменения, которым подвергаются селектированных гены от дальнейшей деградации защищаются ДНК-носителем путем включения селектированных генетического материала в структуру ДНК-носителя и создание трансгенома, имеющая новые свойства. При отсутствии ДНК-носителя селектированных гены, в которых под влиянием в основном ферментативной действия клеток-реципиентов произошли структурные изменения, элиминируют, а в реципиентний клетке остаются введены интактные очищенные или клонированные гены.
В связи с этим в трансформированных клетках одновременно могут находиться интактные молекулы экзогенной ДНК и молекулы ДНК, в которых произошли структурные изменения. Трансформированные с помощью суммарной ДНК реципиентни клетки характеризуются фенотипом, что может иметь стабильный или нестабильный проявление. Есть данные, свидетельствующие о том, что стабилизация трансформированного фенотипа является следствием амплификации донорского гена или включение этого гена в геном реципиентнои клетки, хотя наряду с этим есть возможность функционирования механизмов, препятствующих включению экзогенной ДНК в геном клетки-реципиента.
Появление стабильных трансформантов наблюдали при интеграции донорского генетического материала, в том числе ДНК клонированных генов, в хромосомы реципиентних клеток, что приводило к дестабилизации последних и возникновения в связи с этим большого количества хромосомных перестроек. В образованных в результате интеграции донорских генов, введенных в геномный материал реципиентних клеток как с помощью тотальной ДНК, так и очищенных или клонированных генов, в стабильных трансформантов через их неустойчивость наступает процесс дестабилизации. Этот процесс не всегда является следствием потери интегрированного донорского гена, иногда меняется экспрессия донорского гена, в связи с чем трансформированный фенотип не реализуется.
Взаимосвязь между состоянием трансгенов (стабильное - нестабильное), частотой интеграции донорского генетического материала в геном реципиентнои клетки и частотой нарушения стабильности трансгенов в стабильных трансформантов, с одной стороны, и степенью дифференциации и состоянию кариотипа реципиентних клетки - с другой, прослеживается достаточно четко. Так, линии реципиентних клеток, имеющих измененные гетероплоидни кариотип (фибробластоподобные клетки), способные хранить в своих геномах донорский генетический материал, автономно реплицируется, с нестабильным трансформируемым фенотипом и дестабилизировать трансформированный фенотип в стабильных клонах. Напротив, в ре-ципиентних клетках с близким к нормальному или нормальным кариотипом (половые клетки) нет условий, способствующих нахождению трансгенов в нестабильном автономном состоянии. Поэтому при трансформации реципиентних половых клеток экзогенной ДНК наблюдается большое количество стабильных трансформантов.