Для переноса генов в соматические клетки используют как тотальную ДНК, полученную путем очистки препаратов ДНК из спермы лосося, или ДНК из клеточных линий чаще мыши, китайского хомячка и человека, так и клонированы
гены. При трансформации соматических клеток, растущих в культуре, и мутантных линий, созданных на основе клеточных культур, препаратами суммарной ДНК и клонированными генами в большинстве случаев как донорские маркерные гены используются ТК, HPRT, APRT и DFR, кодирующих соответственно ферменты ТК (тимидинки- Назу), ГФРТ (гіпоксантинфосфорибозилтрансферазу), АФРТ (аденінфосфорибозилтрансферазу) и ДФР (дегидрофолатредук-таза). Таким образом, для трансформации клеток млекопитающих в культуре необходим источник донорской ДНК, среда с подходящим буфером и маркированные реципиентни клетки и (или) пригодно селективное среду для жидких трансформантов.
При обработке клеточной культуры препаратами экзогенной ДНК трансформируется примерно одна из миллиона или один из 100 миллионов (10 "6-10-8) реципиентних клеток. Одновременно следует напомнить, что частота трансформации соматических реципиент-ных клеток при использовании в качестве вектора метафазных хромосом была, как правило, на один-два порядка выше. Решающее значение для достижения высокой частоты трансформации соматических клеток экзогенной ДНК имеют источник високомолекуляр-ной ДНК-носителя, должным образом забуферене среду и состояние свижовисияних реципиентних клеток.
В экспериментах по трансформации как донорскую обычно используют полученную из соматических клеток ДНК, размеры которой превышают 100 къ, а оптимальной считается концентрация 500 мкг / мл.
Для повышения эффективности трансформации Серов О.Л. (1985) предлагает обрабатывать DEAE-декстраном препараты очищенной вирусной ДНК, что повышает устойчивость последней в температурной денатурации, гидролитической действия ДНКазы, содержащейся в реципиентний клетке. Это в конечном итоге обусловливает повышение эффективности трансформации. В последние годы стократного повышения эффективности трансформации удалось достичь за счет обработки культуры соматических реципиентних клеток ДНК-кальций-фосфатным комплексом (преципитатом). Успех трансформации зависит от реакции среды, при которой происходит осаждение экзогенной ДНК-кальций-фосфатным преципитатом, от концентрации ДНК, взятой для образования комплекса, от обработки реципиентних клеток диметилсульфоксидом, продолжительности инкубации в культуре соматических реципиентних клеток с кальций-фосфатным преципитатом ДНК. Некоторые из перечисленных параметров не имеют универсального трансформирующего эффекта, а увеличивают число трансформированных реципиентних клеток только в отношении конкретных клеточных линий.
Схемы отбора для рецессивных и доминантных генов разные. ДНК-кальций-фосфатный преципитат проникает в реципиентну клетку в результате адсорбции комплекса на поверхности клеточной мембраны и активного фагоцитоза, что происходит в первые часы инкубации кальций-фосфатного преципитата ДНК реципиентными клетками. При этом установлено, что адсорбция и фагоцитоз является энергозависимыми процессами и при ингибировании клеточного дыхания они подавляются. К часу инкубации кальций-фосфатный преципитат ДНК оказывается на цитоплазматической мембране, затем в вакуолях цитоплазмы, а через 8 ч после начала инкубации небольшая часть экзогенной донорской ДНК достигает ядра реципиентних клеток, находящихся в культуре. На всех этапах проникновения в клетку экзогенная ДНК остается связанной с кальций-фосфатным преципитатом, а размеры и структура донорской ДНК в клетке-реципиен-е сохраняются в течение 24 ч с момента начала инкубации.
Перенос генов в составе суммарной ДНК в реципиентни соматические клетки возможно с помощью таких переносчиков, как липосомы (фосфолипидные пузырьки) или тени эритроцитов, в которые предварительно помещают тем или иным способом выделен препарат нуклеиновой кислоты. Этим способом можно получить большее количество трансформированных соматических клеток, чем при переносе ДНК другими методами. Кроме того, трансформация реципиентних клеток препаратами суммарной ДНК, предварительно заключенного в липосомы, отличается сравнительной простотой.
Липосомы имеют слабую токсичность, они способны защищать нуклеиновые кислоты, находящиеся внутри и другие макромолекулы от деградации. Нет существенных ограничений на изготовление липосом таких размеров, которые позволили бы уложить в них биополиме-ры с молекулярной массой, которая колеблется в широких пределах (от очищенных генов к хромосом). Для обеспечения избирательного сродства к определенным реципиентних клеток и увеличение способности присоединять к мембранам определенных клеточных популяций поверхности липосом можно модифицировать с помощью гликолипидов, лектинов или ковалентно связанных антител. Высказывается мнение, что использование липосом для введения ДНК повышает эффективность трансформации соматических клеток и позволяет проводить исследования с трансформацией тех клеток, для которых другие способы переноса ДНК неприемлемы.
Из известных методов изготовления липосом наиболее подходящим для переноса суммарной ДНК в реципиентни соматические клетки является метод выпаривания из обращением фаз, когда в липосом-ми может включаться ДНК массой 108 дальтон. С целью повышения эффективности переноса ДНК липосомами в соматические клетки используют диметилсульфоксид, этиленгликоль, глицерин, полиэтиленгликоль. Последняя из названных веществ повышает способность ДНК, находящейся в липосомах, трансформировать реципиентни клетки в 10 раз, однако еще более эффективны умеренные концентрации глицерола, в котором выдерживаются клетки после их контакта с липосомами. Есть данные о том, что экзогенная ДНК вируса SV40, помещена в отрицательно заряженные липосомы, оказывается на три порядка инфекцийнишою, чем в случае ее включения в нейтральные липосомы. Что касается динамики процесса, то наиболее эффективна трансформация соматических клеток ДНК, заключенной в липосомы, происходит в первые 30 мин инкубации. Есть также примеры, свидетельствующие о высокой эффективности трансформации растительных протопластов препаратами очищенной ДНК Ти-плазмиды, заключенной в липосомы.
В последние годы успешно разрабатывается вопрос о компетенции к трансформации препаратами экзогенной ДНК реципи-ентних соматических клеток, находящихся в культуре. Убедительные примеры свидетельствуют, с одной стороны, о генетической природе высокой компетенции клеток к трансформации, с другой - показывают, что эффективность переноса экзогенной ДНК зависит от физиологического состояния реципиентних клеток, их тканевой природы и дифференциации.