С генетического материала, носителями которого являются отдельные изолированные хромосомы, возможно создание «библиотек» рекомбинантных ДНК. Этот прием может быть использован как для картирования генов
, так и для их выделения. Способность метода изолированных хромосом, который используют для проведения картирования, превосходит метод гибридизации соматических клеток, но уступает по объему и глубине информации, получают с помощью приемов конструирования рекомбинантных ДНК. Изолированные хромосомы были использованы для картирования гена а-глобина человека. Полученные этим методом результаты согласуются с ранее установленным фактом локализации гена а-глобина в хромосоме 16. Чтобы широко использовать метод изолированных хромосом в решении различных проблем биологии и связанных с ее достижениями прикладных научных направлений (от изучения механизмов генной регуляции к проблемам медицины и отраслей сельского хозяйства), необходимо иметь достаточный набор селективных сред. Для каждой хромосомы нужны селектированных маркеры такой специфичности и доступности, как для выделения трансформантов (трансформанта - это клетки или клеточные клоны, в которых содержится перенесен с помощью ме-тафазних хромосом генетический материал). Чужеродный генетический материал, перенесенный в реципиентни клетки, называется трансгенов. Если объем этого материала такой, что его присутствие в реципиентний клетке определяется цитогене-ким путем, говорят о макротрансгеном. Микротрансге-ном - это то количество перенесенного с помощью метафазных хромосом генетического материала, цитогенетическим путем установить невозможно. При этом следует иметь в виду, что такая хромосома человека, как 16, содержит ген, кодирующий аденинфосфо-рибозилтрансферазу, 17-ген, кодирующий тимидинкиназу, и Х-хро-мосомах - ген, кодирующий гіпоксантинфосфорибозилтрансферазу.
Перенос генетического материала в реципиентни клетки является многоступенчатым процессом. Для получения большого количества митотических клеток их задерживают в стадии митоза (синхронизация клеток), а затем выделяют метафазные хромосомы, суспензией которых обрабатывают реципиентни клетки. Следующая стадия - выделения, размножения и анализ трансформантов (идентификация признаки донорского генома в трансформанта). Источником метафазных хромосом (донорские клетки) чаще являются фибробласты первичных культур или фибробластоподобные клетки первичных линий клеток лягушки, китайского хомячка, мыши, крысы, человека, генотип которых относится к дикого типа. Эукариотические клетки, в которых из донорских клеток с помощью метафазных хромосом переносится генетический материал (реципиентни клетки), является мутантными линиями. В их клетках не реализуется гіпоксантинфосфорибозилтрансферазна, тимидинкиназна, аде-нозинфосфорибозилтрансферазна, аргининсукцинатсинтетазна активность. О переносе, что произошло, макро-или микротрансгенома из донорской в реципиентну клетку свидетельствует установление в последний ранее отсутствующей ферментативной активности и способности этих клеток расти на соответствующих селективных питательных средах. Перенесенный из донорских клеток, являющихся носителями таких кодирующих генами свойств, как резистентность к высоким концентрациям метатрексата, что выступает как ингибитор дегидрофолатредуктазы, а также таких признаков злокачественности, как способность расти на агаровой среде или при низких концентрациях сыворотки, генетический материал в нормальных по этим признаками реципиентних клетках обусловливает индуцирования свойств, присущих донорским клеткам. Это, с одной стороны, подтверждает факт переноса, что произошло, а с другой - является приемом изучения морфологии и биохимии хромосом.
Чтобы добиться успеха в переносе генов с помощью мета-фазных хромосом, прежде всего необходимо получить в монослой-ной культуре большое количество митотических клеток. Для этого используется прием, заключается в синхронизации клеток с помощью введения в среду колхицина или колцемиду (0,06 мкг / мл). Благодаря этому приему клетки задерживаются на стадии митоза и в клеточной популяции количество их достигает 94-97%. Остановлены на стадии метафазы клетки монослойный культуры бывают слабо прикреплены к субстрату и при встряхивании легко отделяются от него и всплывают. Клетки млекопитающих культивируются в культуре при температуре 37 оС, а для выращивания куриных клеток температуру доводят до 41 оС.
Для выполнения следующей операции (разрушение клеточной мембраны) метафазные клетки помещают в гипотонический раствор. Высокая эффективность разрушения клеточных мембран и освобождение метафазных хромосом достигается при использовании гомогенизаторов типа Даунса или шприцев (5 мл) с тонкой иглой (№ 22), через которую пропускают клеточную суспензию. При выполнении этих операций используется нейтральный буферный раствор (pH 7), состоящий из трис-HCl (0,02 моль / л), гексиленгликоль или детергентов (тритон Х-100, твин-80), а для стабилизации хромосом вводят ионы Са2 +; Mg2 +. Все операции выполняются в стерильных условиях.
Процедура разрушения клеток контролируется фазовокон-трастним микроскопом. Предпочтение отдается осторожном разрушению клеточных мембран, так как при грубой процедуре выделения повреждаются не только клеточные мембраны, но и хромосомы, структура которых в дальнейшем не возобновляется.
Контролируемым параметром при выделении метафазных хромосом температурный режим. Обособленные тем или иным способом синхронизированы митотических клеток инкубуються в свежем среде при 4 оС, что приводит к инактивации трипсина, растворения возможных остатков колцемиду и спонтанного разрушения тех микротрубочек, сохранившихся после обработки колцемидом. Это снижает способность хромосом к агрегации и уменьшает их загрязнения. Следующее центрифугирования клеточной суспензии, удаления надосадочной жидкости пастеровской пипеткой и отмывание осадка нейтральным буферным раствором проводятся при 4 оС. Образован после очередного центрифугирования осадок ресуспендують в охлажденном буферном растворе и инкубируют 10-15 мин на водяной бане при 37 оС. Операции по разрушению клеток и освобождения метафазных хромосом осуществляются при температуре 37 оС и проводятся быстрее. Для последующих этапов переноса хромосом необходима низкая температура (4 ° С). Кислые буферные системы при получении метафазных хромосом используют реже, так как высокая концентрация ионов водорода в сочетании с двухвалентными катионами способствует агрегации остатков цитоплазмы мешает получению чистых препаратов хромосом.
Во избежание загрязнения изолированных метафазных хромосом интерфазных ядрами и неразрушенными клетками, проводят цитологический анализ полученных препаратов. В препаратах изолированных хромосом, свободных от загрязняющих компонентов, отношение белок: ДНК равен 2,2, а РНК: ДНК - менее 0,1; изолированные метафазные хромосомы при температуре 5 ° выдерживают длительное хранение без каких-либо заметных изменений морфологических свойств, хотя молекулярная масса хромосомной ДНК неуклонно уменьшается, что, очевидно, является следствием загрязнения препаратов хромосом эндонуклеазами. Поэтому для переноса генов, как правило, используют метафазные хромосомы, содержащие высокополимерных ДНК с молекулярной массой не менее 100 млн., сразу после их выделения.
Клетки-реципиенты на стадии логарифмического роста обрабатывают концентрированной суспензией очищенных метафазных хромосом. Отношение количества донорских хромосом, прилагаемых к количеству хромосом, содержащихся в геноме реципиентних клеток, составляет 1:1. В экспериментах обычно используется 5-10 млн реципиентних клеток.
Частота переноса селектированных гена-маркера ГФРТ китайского хомяка в клетки мыши составляет 10 "7-10" 6 в пересчете на одну реципиентну клетку. Для увеличения частоты переноса генов к суспензии метафазных хромосом в нейтральном фосфатном буфере добавляют такое количество хлористого кальция, чтобы конечная концентрация достигла 0,125-0,250 М. Происходит совместное осаждение фосфата кальция и метафазных хромосом. При добавлении их в монослоя реципиентних клеток повышается эффективность переносу функционального гена в 10 раз, а сочетание описанного метода с последующей инкубацией монослоя реципиентних клеток в среде с 7-10% конечной концентрацией диметилсульфоксида повышает эффективность переноса генов в 100 раз. Использование инактиво-ного вируса Сендай при инкубации реципиентних клеток, находящихся на стадии метафазы, с суспензией донорских хромосом, повышает эффективность переноса примерно в 10 раз, а заключение изолированных метафазных хромосом в искусственную липидную мембрану позволяет доказать эффективность переноса до 10-5 в расчете на одну реципиентну клетку.
Как уже было отмечено, реализация потенциальных возможностей метода переноса метафазных хромосом в реципиентни клетки значительной мере тормозится из-за трудностей, возникающих при их идентификации. В последние годы предложены методы, позволившие значительно повысить объективность идентификации хромосом. Среди этих методов следует назвать последовательное дифференциальное окрашивание хромосом с Гимза и акрихином на G / Q-полосы; разделение изолированных метафазных хромосом на группы по их размерам при центрифугировании в градиенте сахарозы. Для массового выделения однотипных хромосом предлагается использование метода фракционирования в градиенте плотности с последующей сортировкой полученной фракции методом проточной ци-тометрии. Полученный таким путем хромосомный материал предназначен для использования в биологических экспериментах. Фракция, обогащенная после центрифугирования в градиенте сахарозы однотипными хромосомами, затем сортируется методом проточной цитометрии, что значительно повышает эффективность этого приема сортировки.
В кариотипе большинство хромосом незначительно различаются по количеству ДНК, а используемые для проточного цитометрич-ного сортировки стандартные приборы не могут идентифицировать хромосомы различаются по содержанию ДНК менее чем на 3-5%. В связи с этим можно выделить не индивидуальные хромосомы, а их основные группы. Так, кариотип человека этим путем разделяется на хромосомные группы А, B, C, D, E, F, и G. Увеличение возможности метода проточной цитометрии до 1% уровня различий, проявляющихся в хромосомах в содержании ДНК, позволяет при анализе 24 хромосом человека получить уже не 7, а 18 отдельных пиков.
Донорские хромосомы проникают в реципиентни клетки благодаря фагоцитоза. Есть данные, свидетельствующие о том, что метафазные хромосомы попадают в ядро реципиентних клеток в недеградованный состоянии и эти хромосомы в геноме реципиентнои клетки могут храниться длительное время и имеют способность к автономной репликации. Однако в лизосомах цитоплазмы реципиентних клеток значительная часть донорского хромосомного материала деградирует на стадии проникновения.
Результаты биохимического и цитогенетического анализа тран-сформантив позволяют говорить о двух видах трансформированного фенотипа. В случае стабильного фенотипа перенесена признак при росте трансформантов на неселективному среде сохраняется в течение нескольких недель или месяцев; нестабильный фенотип при выращивании трансформированных клеток на неселективному среде теряется. В последнем случае несмотря на то, что перенесен в рецепиентну клетку генетический материал метафазных хромосом находится в ядре и эк-спресуеться, физическую связь его с ядром отсутствует. Кроме того, нестабильный фенотип в популяции трансформированных клеток теряется со скоростью 0,1-10% и больше клеточное деление, что также свидетельствует о незавершенности процесса трансформации.
При более или менее длительном культивировании клетки с нестабильным трансформируемым фенотипом постепенно переходят в стабильные трансформантов. Данные о возможности перехода сформированного стабильного фенотипа в нестабильный в литературе не приводятся. Что касается процесса формирования стабильного трансформированного фенотипа, то есть основания говорить о включении донорского генетического материала в хромосомы реципи-ентних клеток с одновременным уменьшением объема перенесенного в реципиентни клетки генетического материала (объем этого материала колеблется от 1% (макротрансгеном) до 0,07-0 , 8% (мик-ротрансгеном) и зависит от многих факторов).
Один из ведущих специалистов по переносу генов с помощью метафазных хромосом Серов О.Л. (1985) считает, что изучение таких вопросов, как механизм включения донорского генетического материала в геном реципиентнои клетки и механизм клеточной компетенции к трансформации, позволит с помощью направленного введения генетического материала осуществлять значительные изменения фенотипа реципиентних клеток.
Загрузка...