В молекулярной биологии и генетической инженерии как вектор (переносчик) генов, не имеющих аналогов в ДНК клетке-Реципиента, и поэтому не способны участвовать в гомологичной рекомбинации, чаще всего используют
плазмиды и фаг X. Плазмиды - это небольшие кольцевые молекулы внехромосомных ДНК, что, в отличие от классических генов, находящихся в цитоплазме бактериальных клеток и клеток некоторых дрожжей. В связи с этим плазмиды часто называют екстрахромосомнимы генетическими элементами. Автономное существование плазмид связано с тем, что механизмы, лежащие в основе их репликации, независимые от механизмов, регулирующих размножение бактериальной хромосомы. Плазмиды обладают способностью встраиваться в геном клетки-хозяева-ина и находиться бесконечно долго в интегрированной с ДНК бактерии состоянии. В этом случае генетический материал плазмиды ведет себя подобно хромосомным генам бактерии, в которые она вмонтувалася. Известные сегодня плазмиды различаются между собой размерами, что является следствием неодинакового объема генетической информации, содержащейся в них; механизмами регуляции их репликации, зависят от различий в ферментных системах, обеспечивающих эти механизмы. Зависимости от молекулярной массы плазмиды делятся на мелкие (средняя молекулярная масса 5x106) и большие (примерно установлена предельная молекулярная масса 150-106 - 170-106).
В состав молекулы плазмидной ДНК входит от 2250 до 400 тыс. пар нуклеотидов. В клетках бактерий предпочтительной является конфигурация ДНК в виде двухцепочечной ковалентно закрытых кольцевых надспиральних и двухцепной открытых кольцевых молекул ДНК. Конфигурация двухцепочечной ковалентно закрытой кольцевой структуры, при скручивании превращается в надспираль, характеризуется высокой устойчивостью и сохраняется в конформационных измененном состоянии даже при воздействии неблагоприятных факторов (например, щелочных растворов). Плазмиды в бактериальных клетках чаще всего находятся в виде ковалентно закрытых кольцевых надспиральних структур и открытых кольцевых молекул ДНК. Открытые кольцевые молекулы образуются в результате разрыва фосфодиефирних связей в одной из цепей. Они не образуют надспиральнои структуры, находятся в релаксованому (расслабленном) состоянии, менее стабильны при воздействии неблагоприятных факторов, а в щелочных растворах двух-цепная структура быстро деградирует из-за разрыва водородных связей.
В бактериальной клетке одновременно могут находиться плазмиды одного или разных типов. Количество копий мелких плазме-мед бывает, как правило, более десяти; большие плазмиды в большинстве случаев представлены одной или двумя копиями в расчете на одну бактериальную клетку. Определено, что на долю плазмид приходится около 1-10% клеточной ДНК. Так, если исходить из того, что в клетке Е.соии содержится 10 мелких плазмид, молекулярная масса каждой из которых 5-106, а молекулярная масса хромосомной ДНК 2-109, то в плазмидах оказывается сосредоточено 2% клеточной ДНК. Объем информации, сосредоточен в мелких плазмидах, позволяет кодировать молекулы двух крупных белков; в больших плазмидах возможности, кодирующие достаточные для более чем 200 крупных белков. Наличие некоторых общих признаков с умеренными фагами дает основание предполагать существование одной и той же молекулы ДНК в разных фазах - плазмидной и фагов. Известно, например, что фаг X обычно функционирует, убудовуючы свою молекулу ДНК в хромосомную ДНК бактериальной клетки; фаговой ДНК может также воспроизводиться автономно, как размножаются плазмиды. Кроме бактерий, мелкие кольцевые молекулы ДНК (диаметр 1,1-2 мкм) встречаются в цитоплазме клеток эукариот (дрожжах, Neurospora, Euglena, трипаносомы, в клетках табака, дрозофилы, шпорцев лягушки, а также в культурах клеток мышей, обезьян, человека) . На сегодня изучены физико-химические свойства этих ДНК, однако их происхождение и биологическая роль пока не определены.
В 50-е годы ХХ в. усилиями Д. Ледерберга была обнаружена екстрахромосомна генетическая структура бактерий, первоначально известная как фактор фертильности, конъюгации, генетического переноса. Для обозначения этой структуры был предложен символ F. Клетки, являются носителями этого фактора, стали называть клетками F +; в тех случаях, когда в клетке назван фактор отсутствовал, ее обозначали F-. Кроме того, стало известно, что при конъюгации бактерии двух штаммов, клетки, содержащие фактор F, всегда выступают как донор генетического материала, клетки F-- как реципиент. Передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент происходит за счет конъюгации (аналог полового процесса у бактерий), а структурой, обладающий свойствами полового фактора, оказался фактор F. Последний в связи с его екстрахромосомною (цитоплазматической) локализацией, по предложению Ледерберга Д., стали называть плазме-дой. Таким образом было установлено, что плазмида F приводит только одно свойство бактерий, являются ее носителями, - выступать в качестве донора генетического материала. Обнаружены другими исследователями внехромосомных факторы, сходные с F-плазмиды (плазмиды A, T, FP, P), предоставляют содержащим их клеткам способность доноров генетического материала, а также мобилизуют переноса в кли-тины-реципиенты других неконъюгированных плазмид.
Плазмиды детерминируют устойчивость бактериальных клеток к одному или одновременно к нескольким лекарств и в последнее время широко распространены; их носителями являются практически все виды патогенных для человека и животных бактерий.
Синтез колицинив клетками Е.соии находится под контролем плазмид Сои. Различают несколько видов колицинив А, В, С, D, Е и др.. Среди некоторых из названных колицинив, в свою очередь, выделяют такие варианты как, например, колицин Е1, Е2, Е3. Поэтому в названиях соответствующих плазмид, кроме символа Сои, указываются название синтезированного кишечной палочкой соответствующего вида и варианта колицину - СоиЕ1, СоиЕ2 и т.д. Синтез подобных по биологическому значению с колицинамы веществ (пиоцинив) детерминируется плазмидами, содержащиеся в псевдомонад; стафилококковые плазмиды контролируют синтез стафилококцину, плазмиды картофельной палочки - мегацину и т.д. Общим свойством всех бактериоцинов является их высокая биологическая активность. Для торможения жизнедеятельности бактериальной клетки достаточно нескольких молекул бактериоцинов (высокая эффективность распространяется только на бактерии аналогичного или близкого вида). Колициногенни (бактериоциногенни) плазмиды и детерминированные ими эффекты распространены среди бактерий, но не так часто, как R-плазмиды.
Некоторые плазмиды (Ent, Hly, K88, K99) локализуются только в клетках энтеропатогенных штаммов Е.соии. Так, низкомолекулярный термостабильный и высокомолекулярный термостабильный энтеротоксины синтезируются под контролем плазмид Ent. Зависимости от того, одна из двух плазмид находится в клетке или их комплекс, клетки кишечной палочки синтезируют один из двух названных энтеротоксинов, или оба вида ентеротоксы-нов одновременно. Синтез а и ß-гемолизинов (белковых веществ, вызывающих гемолиз эритроцитов) энтеропатогенную клетками кишечной палочки детерминируется плазмидами Ниуа и Н1уß соответственно. Они, как и плазмиды Ent, могут находиться в клетке как в одиночку, так и обе одновременно. В связи с этим клетка синтезирует один из двух названных энтеротоксинов, или оба вида одновременно. Совместное пребывание в клетке плазмид К88 и К99, контролирующих синтез поверхностных антигенов 88 и 99, с плазмидами Ent повышает патогенность таких клеток бактерий. В клетках многих штаммов Рsеudоmonas риШа локализованы плазмиды, каждая из которых детерминирует биосинтез фермента для утилизации какого-то одного класса углеводородов. Так, плазмиды SAL расщепляют салициловую кислоту, XYL - ксилол и толуол, NAN - нафталин, САМ - камфору, ОСТ - октан, гексан и декан. Все названные плазмиды удается идентифицировать по контролируемыми ими признаками, которые проявляются фенотипически. Плазмиды, существование которых в клетках бактерий фенотипически не проявляется (а для их идентификации необходимо применение биохимических методов), называются критическими. Эти плазмиды еще мало изучены.
Прежде чем плазмиды стали использовать как незаменимые объекты молекулярной биологии и генетической инженерии, были изучены их общая и специальная функции. У всех видов плазмид выявлены следующие общие функции, как способность реплицироваться (гер), несовместимости (ИПС), переноса (tra - от англ. Transfer - перенос).
Плазмиды - это молекулы ДНК, поэтому за счет репликации регулярно увеличивается количество плазмидных копий и они равномерно распределяются между потомками бактериальной клетки, делится. Лучше изучен механизм репликации мелкой плазмиды СоиЕ1, представленной в клетке, как правило, большим числом копий (Зенгбуш П., 1982). В процессах инициации и элонгации участвуют продукты хромосомных генов, а для репликации СоиЕ1 необходимые ДНК-полимераза III и ДНК-полимераза И. Последний фермент в репликации хромосомной ДНК кишечной палочки не участвует, а используется там в репарационных целях. Высказывается мнение о том, что только начало репликации плазмиды СоиЕ1 детерминируется ее генным аппаратом, другие функции, обеспечивающие репликацию плазмиды, реализуются с участием хромосомного аппарата бактериальной клетки. В некоторых плазмид, в клетке находятся в небольшом количестве (1-2 или немного больше копий на хромосому), существует собственный, независимый от хромосомы аппарат, обеспечивающий репликацию. К таким плазмид прежде всего относятся факторы F, R1, рSCЮ1 и другие.
О реальном существовании процесса репликации плазмид свидетельствуют косвенные данные, к которым прежде всего следует отнести тот факт, что количество плазмид в расчете на хромосому бактериальной кли-тины-хозяина всегда является величиной постоянной. С другой стороны, если предположить, что процесс репликации несвойственный плазмиды, то при любой первоначальной количества плазмид в бактериальной клетке, делящегося всегда наступить момент, когда эта бактериальная клетка освободится от плазмидных структур. На самом деле такой феномен исчезновения плазмид с плазмидвмисних клеток пока никем не был установлен. Есть другие примеры, подтверждающие факт размножения плазмид.
Молекулярный механизм размножения плазмид сих пор полностью не изучен. Имеющиеся гипотезы, которые допускают существование положительного и отрицательного контроля размножения плазмид, не в состоянии объяснить существующие факты. Так, например, гипотеза положительного контроля базируется на том, что размножение плазмид F и F 'находится под контролем собственной генетической системы, представленной только двумя генами, один из которых осуществляет контроль синтеза белкового продукта выступает как инициатор процесса репликации, а второй ген является оператором репликации (репликатор). Схема генетического контроля размножения плазмид F или F "предполагает, что размножение наступает в тот момент, когда нет ограничений для функционирования инициатора (белковой субстанции) и репликатора. Вместе с тем установлено, что в процессе инициации синтеза ДНК плазмиды СоиЕ1 репликация не прекращается, несмотря на присутствие такого ингибитора белкового синтеза, как хлорамфеникол. Точку зрения о наличии у плазмид собственной системы репликации разделяют многие специалисты, однако функциональная активность этой системы находится в зависимости от уровня жизнедеятельности бактериальной клетки. Так, пребывание бактериальной культуры в неблагоприятных для ее размножения условиях сопровождается увеличением количества плазмид в бактериальной клетке. Кроме того, в зависимости размножения плазмид от метаболической активности бактерии указывает факт возможного участия РНК запала при репликации плазмидной ДНК.
Познание механизма размножения плазмид не является частным вопросом. Его значение в том, что на примере репликации плазмидной ДНК изучаются фундаментальные механизмы репликации генетического материала вообще, что имеет практическое применение при разработке методов преодоления лекарственной устойчивости бактерий, а также ограничения распространения бактерий, являющихся носителями R-плазмид.
Функция несовместимости (ИПС) плазмид - это биологическое явление, проявляющееся при окраске, и означает, что две одинаковые плазмиды не могут стабильно существовать в одной клетке; попав при скрещивании с клетки-донора в клетку-реципиент плазмида вытесняет подобную плазмиду («резидента» ), или же вытесняется ею. Молекулярный механизм несовместимости пока невыясненным.
Наряду с несовместимостью при изучении взаимодействия бактерий было установлено близкое к этому явление, получившее название поверхностного исключения. Скрещивания клеток доноров и клеток-Реция-пиентив, являющихся носителями подобных плазмид F, R или Сои, неизменно сопровождается неприятием реципиентною клеткой плазмидного материала из клетки-донора. Хотя есть достаточно убедительные данные, указывающие на существование плазмидного генного контроля поверхностного исключения, молекулярный механизм этого явления до сих пор однозначно не установлен. Что касается несовместимости плазмид, то ни гипотеза конкуренции плазмид за мембранный сайт (участок) репликации, ни гипотеза отрицательного контроля размножения не могут полностью объяснить молекулярный механизм этого явления.