Разработка технологии конструирования рекомбинантных ДНК является одним из важнейших достижений молекулярной биологии. Молекулы ДНК, в том числе и гигантские молекулы ДНК еукариот, содержащие
интересующие исследователя гены, с помощью ре-стрикцийних эндонуклеаз (рестриктаз) расщепляют на отдельные фрагменты. Заслуживает внимания то обстоятельство, что с помощью одного и того же фермента рестрикции осуществляют расщепление как молекулы ДНК, с которой планируется получение необходимого гена, так и ДНК вектора (плазмиды или умеренного фага). В этом случае рестрикционных эндонуклеаз, например EcoRI, что бактериальное ферментом, расщепляет короткие палиндромни (имеющие ось симметрии второго порядка) последовательности в специфических местах внутри этих последовательностей наискось в обеих цепях хромосомной ДНК и ДНК вектора с образованием комплементарных одноцепочечных выступлений, называются липких концов. Очень важно, что с помощью ферментов удается хромосомную ДНК, из которой образуется множество фрагментов, и ДНК плазмиды перевести в линейную форму, а затем одноланцюгови комплементарные конце фрагмента крупной молекулы ДНК и плазмиды подвергнуть отжига, что ведет к соединению липких концов в результате спаривания азотистых оснований, а имеющийся в структуре отожженной ДНК разрыв устранить с помощью легкодоступного бактериального фермента ДНК-лигазы (рис. 5.1).
Известны и другие методы, применяемые в генетической инженерии (конекторний, линкерний), с помощью которых достигается соединение неродственных молекул ДНК. Соединение двух неспе-риднених молекул ДНК конекторним методом достигается за счет ферментативного присоединения с помощью конечной трансферазы (дезоксинуклеотидилтрансферази) поле ^ А)-фрагментов к обоим 3'-концов одной из двух неродственных молекул ДНК; к обоим 3'-концов второй неродственной молекулы ДНК присоединяют фрагменты поле ^ Т). Для соединения 3'-концов двух-цепной структуры ДНК можно использовать гомополи-мерном нуклеотидные последовательности, состоящие из гуанинового и цитидилового нуклеотидов. Особенностью терминальной дезок-синуклеотидилтрансферазы является независимость ее действия от присутствия полинуклеотидных матрицы, в связи с чем удлинение 3'-концов молекул ДНК, соединяемых возможно за счет гомополи-мерном нуклеотидных последовательностей длиной около 100 остатков. В связи с тем, что присоединенные к 3'-концов однотипные полинуклеотидных последовательностей могут иметь разную длину, дефекты, возникшие в связи с этим в двуспиральной структуре ДНК, достраиваются за счет ДНК-полимеразы I.
Соединение фрагментов ДНК и вектора, образованных в результате действия соответствующих ферментов рестрикции, осуществляют с помощью метода, включающего в себя элементы методов коннектор-ного и липких концов. Для этого предварительно химическим путем синтезируют олигонуклеотидных фрагмент, состоящий из 6-10 пар нуклеотидных остатков. Этот фрагмент выполняет соединяющую функцию, и поэтому называется Линкер. С его помощью соединяются конце клонированного фрагмента ДНК и вектора, в который этот фрагмент вводится для образования рекомбинантных молекул ДНК. Предварительным условием при создании линкера является возможность последующего его расщепление соответствующей ре-стрикцийною эндонуклеазой. Затем к 3'-концов плазмидного или иного происхождения вектора и фрагментов ДНК присоединяют с образованием ковалентных связей заранее синтезированный линкер (соединительный цепь), а 5'-конце линкера клонированного участка ДНК и ДНК вектора фосфорилирует с участием полену-клеотидкиназы и с помощью лигазы (фага Т4), образует ковалентную связь между тупыми концами ДНК. Тупые концы, образованные присоединением линкера к клонированного фрагмента ДНК или вектора после ферментативной обработки соответствующей рестриктазы, например EсоRI, превращают в липкие концы (рис. 5.2), в основе соединения которых лежит механизм, описанный выше. На стадии выделения клонированных генов суммарную ДНК клет-ни-донора (например, млекопитающего) с помощью ферментов РЕСТРА-ктаз, выполняющие роль своеобразного защитника, который охраняет клетку от вторжения чужеродной ДНК, расщепляют на фрагменты размером от 1 до 30 тыс. нуклеотидов. Сложный геном удается разделить на несколько сотен тысяч полинуклеоты-дних фрагментов, каждый из которых можно встроить в молекулу ДНК вектора. Важно, чтобы полинуклеотидных фрагмент ДНК клетки-реципиента, встраиваемая, не превышал полену-клеотиднои емкости вектора используется. Из фрагментов, образующихся при расщеплении ендонуклеа-замы суммарной геномной ДНК и ДНК вектора (плазмиды или бактериофага) с помощью метода липких концов, конекторного или комбинированного (линкерного) методов в присутствии ДНК-ли-газы получают молекулу рекомбинантной (гибридной) ДНК. В присутствии всех необходимых компонентов процесс образования ре-комбинантнои ДНК завершается в течение нескольких минут.
Следующая стадия на пути клонирования рекомбинантной ДНК - введение этих гибридных молекул, состоящих из Убу-дований в ДНК вектора клонированных фрагментов ДНК, в том числе эукариотических организмов, в бактериальную клетку-хозяина. Процесс проникновения так называемых голых молекул ДНК в бактериальную клетку и способность их предоставлять этим клеткам новых наследственных признаков описаны американскими исследователями из лаборатории Эйвери А.Т. (1944). Явление поглощения ДНК из среды бактериальными и эукариотических клеток получило название трансформации. Эффективность трансформации очень низкая: только одна из миллиона молекул ДНК проникает в клетку. Создавая особые условия, количество трансформированных клеток можно значительно увеличить.
Важным условием получения рекомбинантных молекул ДНК является выбор таких плазмид, в которых была бы только один участок специфического взаимодействия с определенной рестрикционной эндонуклеазой. При соблюдении этого условия кольцевая плазмидная ДНК при ферментативном расщеплении превращается только на одну линейную молекулу. Если в плазмиде есть несколько палидромних последовательностей, с которыми специфически взаимодействует фермент рестрикции, то в результате его гидролитической действия плазмидная ДНК распадается на несколько фрагментов. Для получения рекомбинантных молекул ДНК необходимо создать мелкие плазмиды с высокой скоростью их размножения.
Сейчас при создании новых векторов уже на стадии планирования ставится задача получения таких рекомбинантных молекул, которые, имея другие необходимые свойства, сравнительно легко могли бы проникать в клетку-хозяина. Такие требования удовлетворяет вектор, сконструированный на основе мутантной формы фага X, получивший название X g tX. Под влиянием рестриктазы EœRI этот мутант расщепляется в двух местах (количество мест расщепления под влиянием рестриктазы в дикого типа достигает пяти). Важным моментом, что позволяет использовать этот фагов мутант как вектор, и то, что значительные участки его ДНК можно удалить, не изменив при этом инфекционных свойств бактериофага. На долю ДНК, оставшейся после расщепления ЕсоШ, приходится 72% длины вирусного генома. Образовавшийся дефект после элиминации участки вирусной ДНК, можно заполнить фрагментом ДНК размером 10 kb, который предназначен для клонирования. В таком случае гибридная молекула ДНК, созданная на базе фага X и имеет 93% первоначальной длины (до обработки ре-стриктазою), может быть инкапсидована (упакована) в головке вируса. Одним из основных преимуществ созданных на основе фага X векторов является их способность проникать в бактерии с эффективностью, значительно превосходит таковую же у гибридных молекул, сконструированных на плазмидной основе.