Введена тем или иным путем в бактериальную клетку ре-комбинантна молекула ДНК многократно там реплицируется. Каждая гибридная молекула ДНК в результате репликации создает потомство идентичных ей
дочерних молекул. Многократно размножены потомство одной бактериальной клетки, характеризуется идентичностью всех составляющих его молекул, называют клоном. Фрагмент ДНК, предварительно полученный в результате расщепления рестрикционных эндонуклеаз геномной ДНК (например, эукариотического организма), в пределах каждой кло-нальной популяции присутствует в чистом виде, единственной примесью которого является ДНК-вектор, содержащейся в гибридной молекуле. Поэтому в более узком смысле клоном называют встроенный фрагмент чужеродной ДНК, предварительно выделен из его первоначального геномного окружения и в результате выборочного размножения присутствует в большом количестве копий в однородной популяции гибридных молекул. Как было сказано выше, в плазмидные или вирусные векторы могут участвовать различные фрагменты ДНК, несущие в своем составе различные гены, в связи с чем образуются сотни тысяч гибридных молекул, различающиеся, которые при размножении образуют клональный популяции. Родоначальницей каждой популяции есть одна гибридная молекула ДНК. При использовании в качестве вектора бактериофага гибридные ДНК, образовавшихся и состоящие из фрагмента геномной ДНК эукариотического происхождения и ДНК вируса, вводят в клетки Е.соии. Рекомбинантные фаги многократно размножаются в клетках Е.соии; в результате их лизування получают большой набор отдельных клональных популяций - библиотеку клонов.
Следующий этап - идентификация клонов. Задача состоит в том, чтобы в библиотеке клонов найти одну или несколько популяций, несущих рекомбинантную молекулу ДНК и содержащих нужный ген. Отбор клонов можно проводить с признаками, характерными для самого клонированного гена или для вектора, в который встроен нужный ген. Идентификация является сравнительно простой манипуляцией, если раньше был клонирован семейный нужном ген. Клон-ваний ранее фрагмент ДНК обозначают радиоактивным изотопом и устанавливают необходимый клон гибридизацией. При этом учитывается то обстоятельство, что радиоактивное ДНК в связи с ком-плементарнистю нуклеотидных последовательностей будет связываться преимущественно с клонированным фрагментом ДНК, разыскиваемый. Что касается идентификации клонированных фрагментов еукариотич-ной ДНК, то и здесь основой отбора является гибридизация.
Разработаны приемы, с помощью которых можно выделить иРНК (на ее матрицы осуществляется синтез соответствующего белка) и ее ДНК-копию. В тех клетках, которые специализированы для синтеза определенного белка в больших количествах, иРНК также проявляется в концентрациях, позволяющих сравнительно легко выделить ее, а также ДНК-копию соответствующего иРНК в количествах, необходимых для тестирования гена, разыскивается. Этот метод оказывается результативным и в тех случаях, когда иРНК находится в клетке, где ее количество составляет десятые доли процента относительно других матричных РНК. Этот метод может быть использован и тогда, когда из-за малого количества существующих приемов иРНК не может быть изолированной. Предложенный выход из положения заключается в выделении небольшого количества чистого белка, биосинтез которого осуществляется на матрице иРНК, которая интересует исследователя. Затем определяется аминокислотная последовательность этого белка и на основании знания генетического кода осуществляется определение нуклеотидной последовательности соответствующей иРНК и ДНК, кодирующий рассматриваемый белок. На следующем этапе из отдельных нуклеотидов химическим путем синтезируют небольшие олигонуклеотидных фрагменты ДНК с необходимой последовательностью азотистых оснований. Эти фрагменты ДНК дальнейшем используются как тесты для идентификации и выделения клонов, разыскиваемых.
С целью идентификации и отбора клонов используется иммунологический метод. В этом случае выделяется чистый белок, кодированный геном, находящийся в составе рекомбинантной ДНК у фагов векторе. При введении в бактериальную клетку гибридного фагового вектора одновременно с его увеличением осуществляется биосинтез небольших количеств этого белка. Дальнейшая задача состоит в том, чтобы против нужного белка получить антитела и использовать приготовленный на их основе препарат для идентификации и отбора клона, содержащего ген, который разыскивается.
Полученные в результате расщепления рестриктуючимы эндо-нуклеазами суммарной ДНК эукариотических и прокариотических организмов фрагменты, содержащие гены, кодирующие тот или иной белок, могут быть использованы для встраивания их в векторы и создания рекомбинантных, или гибридных ДНК. Бактериальные гены, участвующие в образовании рекомбинантных молекул, встроенные в векторы в составе фрагментов ДНК, можно заставить экспрессироваться. Так, во фрагменте ДНК, полученной при действии рестриктазы на геномный материал Е.соии, оказался триптофан-ный оперон. Его клонирования в составе рекомбинантной молекулы ДНК, состоящая из фрагмента ДНК из триптофанового опероном и плазмидного вектора СоиЕИ, приводит к экспрессии. Концентрация ферментов, кодируемых генами триптофанового-го оперона, входящий в состав плазмидного вектора СоИЕИ, примерно в 20 раз превышает их содержание, синтезированный в обычных клетках Е.соии. Это связано с тем, что количество гибридных молекул плазмиды СоиЕИ в клетке Е.соии может достигать нескольких десятков копий. Обычно в бактериальной клетке около 25 копий плазмиды СоиЕИ, а при действии на бактерию антибиотиком хлорамфениколом количество плазмид СоиЕИ увеличивается, достигая 1000 копий. Механизм действия хлорамфеникола сводится к блокированию процессов биосинтеза белка и репликации хромосомы бактериальной клетки; репликация ДНК плазмиды СоиЕИ в присутствии антибиотика не нарушается.
Общим свойством колициногенних плазмид, в том числе и, является отсутствие четкого контроля их репликации. Есть примеры, которые свидетельствуют о возможности экспрессии в бактериальной клетке генов, взятых из дрожжей. Так, мутант Е.соии, что требует для своего роста обогащенного гистидина питательной среды, становился независимым от экзогенных поступлений этой аминокислоты при трансформации ауксотрофнои клетки реком-бинантною ДНК, состоящий из фрагмента дрожжевой ДНК и фага X. Подтверждением того факта, что ген, кодирующий фермент імідазолілгліцеролфосфатдегідрогеназу, вставленный в фаг X в составе фрагмента дрожжевой ДНК, експресувався, является превращение мутанта Е.соии в независимую от внешних поступлений гистидина клетку. Что касается генов млекопитающих, есть данные, по которым бактерии не способны экспрессировать эукариотические гены, содержащие интроны. Как уже отмечалось, в отличие от прокариот эукариотические гены не являются непрерывными структурами.
В связи с этим молекула, образовавшаяся в результате транскрипции РНК (первичный транскрипт), прежде чем оказаться в цитоплазме, проходит стадию созревания (процессинг), во время которого синтезирована молекула РНК ферментативным путем расщепляется на отдельные фрагменты. Некоторые из полученных фрагментов соединяются между собой (сплайсуються), а большая часть нуклеотидных последовательностей при процессинга выводится из первичного транскрипта. В результате из первичного транскрипта выходит иРНК. Однако в бактериальной клетке, очевидно, отсутствуют возможности для обеспечения процессинга первичного транскрипта. Поэтому, если даже предположить, что эукариотический ген экспрессируется в бактериальной клетке, то полученный в результате трансляции недозрелыми иРНК белок не будет идентичен тому, который мог образоваться в результате экспрессии этого же гена в эукариотической клетке.
Выход из создавшегося положения, может быть достигнута, если при конструировании рекомбинантных молекул в плазмидный или вирусный вектор встраивать фрагмент еукарио-ческого ДНК, комплементарный зрелой иРНК. Практическое решение этого вопроса стало возможным после того, как была установлена обратная транскрипция иРНК с помощью фермента ревертазы (обратной транскриптазы). Обратная транскриптаза кодируется геном РНК-содержащих вирусов, которые инициируют опухолевый рост.
Для решения вопросов молекулярной биологии и генетической инженерии обратную транскриптазу в основном получают из вируса миелобластозу птиц. Важным свойством обратной транскриптазы является ее способность синтезировать на матрице иРНК комплементарный цепь ДНК и создавать на этой цепи ДНК шпилькоподибну структуру, другим ферментом-ДНК-полимеразой - используется как отжиг при синтезе другой цепи ДНК. Стоит обратить внимание и на тот факт, что обратная транскриптаза кодируется не только геномом РНК, содержащий вирусы, инициируют опухолевый рост, но оказывается и в нормальных клетках мыши и человека, где она выполняет, скорее всего, определенную нормальную функцию.
Искусственно синтезированная на матрице, которая прошла стадию про-цесингу, иРНК - копия двухцепочечной комплементарной ДНК (кДНК) содержит непрерывную генетическую информацию, то есть бе-зинтронним искусственным геном. Кодированная участок гена яичного альбумина (овальбумину) состоит из восьми отдельных участков, разделенных интронов, которые расположены в разных местах генома. Овальбуминова иРНК, нуклеотидной последовательностью которой расшифрована, содержит всю информацию о овальбумин, состоящий из 387 аминокислотных остатков. Обратной транскрипцией овальбуминовои иРНК получена кДНК, в результате экспрессии которой в составе рекомбинантной ДНК в клетках Е.соии образуется около 1,5% овальбумину; значительная часть его выделяется из клетки.
Примером получения необходимого для клонирования Безина-тронного гена может служить процесс создания кДНК на матрице иРНК препроинсулину - предшественника функционально активного гормона инсулина. Было известно, что в клетках инсульта номы (опухоли поджелудочной железы) синтезируется большое количество инсулина, и клетки этой опухоли содержат сравнительно высокую концентрацию иРНК препроинсулину, в который во время процессинга изъяты интроны. Экспрессия рекомбинантной ДНК, созданной встраиванием в плазмидный вектор кДНК, кодирующий безинтронну иРНК препроинсулину в клетках Е.соии, позволила дать ответ на два вопроса, интересующие исследователей. Во-первых, была доказана возможность экспрессии генов млекопитающих в бактериальных клетках. Во-вторых, биотехнологический способ получения инсулина для удовлетворения потребностей практической медицины оказался более рентабельным по сравнению с ранее разработанным методом химического синтеза.
Если известна аминокислотная последовательность белка (производство его предполагается наладить на биотехнологической основе), одновременно с генетическим проводится химико-фермента-тивный синтез гена по методике, в основу которой положены разработки лауреата Нобелевской премии Кораны Г. (1969). Для этого олигонуклеотидных последовательностей синтезируются химическим путем, а затем с помощью фермента лигазы соединяются между собой, в результате чего получается нуклеотидной последовательностью ДНК, кодирующий биосинтез белка проинсулина.
Процесс синтеза генов, кодирующих белки небольших размеров, химико-ферментативным путем можно значительно используя для этой цели «генные машины» (рис. 5.4), в которых синтез специфических последовательностей ДНК автоматизирован.