Поверхностные покровы всех органов растений обычно загрязнены спорами различных микроорганизмов и грибов. Однако внутренние ткани здоровых растений считают стерильными, хотя и в них могут находиться непатогенные
бактерии. Особенно богаты внутреннюю инфекцию ткани тропических и субтропических растений, которые имеют большие сосуды.
Основным условием успешного получения и выращивания каллусных и особенно суспензионных культур является стерилизация растительных объектов, которая заключается в убивании грибных и бактериальных спор на внешней поверхности без повреждения внутренних тканей. Для этого используют различные стерилизующие вещества.
Вид стерилизующей вещества, его концентрация и длительность применения зависят от плотности и чувствительности ткани, которая будет стерилизоваться. Правильный выбор стерилизующей вещества состоит в том, чтобы она пагубно действовала на все микроорганизмы и в то же время минимально повреждала ткани. Еще одним важным условием является то, что стерилизующая вещество должно легко удаляться из ткани промывкой дистиллированной водой или разлагаться. Иначе происходит отравление тканей, что негативно влияет на образование и рост каллуса.
Конечно, режим стерилизации устанавливают экспериментально для каждого объекта. Однако существуют общие правила, которых следует придерживаться.
Перед стерилизацией ткань очищают от остатков земли, засохших листьев, покровных чешуй (клубни, корнеплоды, подземные побеги). Тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, затем промывают проточной водой (40-60 мин) и ополаскивают дистиллятом. Такая предварительная подготовка намного уменьшает контаминацию поверхностных тканей.
Листья, побеги травянистых растений промывают теплой водой с мылом, затем проточной водой (30 - 40 мин) и ополаскивают дистиллятом.
Как правило стерилизацию начинают с погружения растительного материала в 70% этанол: листья, почки на 10 - 20 секунд, семена, клубни, корни - на 1 - 5 мин. Иногда достаточно поверхность побегов, листьев и крупных семян протереть ватой, смоченной спиртом (абсолютным).
Обработка тканей этанолом разрушает восковой налет на листьях, усиливает действие (проникновение) стерилизующих веществ.
Детергент добавляют для смачивания поверхности: 65 - 70% спирт действует как детергент и стерилизатор.
Чаще всего для поверхностной стерилизации растительных тканей используют соединения, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия, гипохлорит кальция, хлорамин), ртутные препараты (сулема, диацид) и окислители (перекись водорода, перманганат калия), этиловый спирт, реже - концентрированную серную кислоту, препараты азотнокислого серебра и антибиотики. Эффективность стерилизации повышается при добавлении на 1 л стерилизующего агента 5-6 капель Твин-80 или Твин-20.
Гипохлорит натрия (NaCIO) используют для стерилизации семян и растительных тканей в концентрации 0,5 - 5% в течение 1 - 20 мин. Гипохлорит натрия является клеточным ядом. Поэтому после стерилизации NaCIO растительные ткани следует тщательно отмыть стерильной дистиллированной водой.
Гипохлорит кальция (Ca (ClO) 2) менее токсичен для тканей растений чем гипохлорит натрия. Ca (CIO) 2 используют для стерилизации клубней, побегов, семян, почек, завязей, цветков, плодов.
Для стерилизации менее загрязненных объектов используют раствор хлорамина в концентрации 0,2-6-10% в течение 20-30 мин.
Растворы, содержащие хлор, используют однократно сразу же после приготовления.
Стерилизующие растворы, содержащие ртуть используют для стерилизации клубней, корнеплодов, семян, побегов древесных растений. Чаще используют 0,1% раствор сулемы (HgCh).
Перекись водорода используют в основном для стерилизации семян в концентрации 10-30% в течение 6-20 мин. Перекись водорода меньше повреждает растительные ткани и после него не требуется длительное отмывания, потому что он быстро разлагается.
Концентрированную серную кислоту используют для стерилизации (5 мин) семена с плотной оболочкой или опушенных. Обработка семян кислотой, кроме стерилизации, способствует более быстрому его прорастанию в результате улучшения водо-и воздухопроницаемости семенных оболочек.
Некоторые растительные ткани (клубни, луковицы) имеют внутреннюю инфекцию (заражения), которой сложно избавиться обычными методами стерилизации. В этом случае используют антибиотики - стрептомицин, ампициллин, нистатин, которые освобождают материал от бактериальной и грибковой инфекции, но плохо влияют на пролиферацию каллуса и регенерацию растений, т.е. ослабляют жизнеспособность эксплантаты.
Техника стерилизации. Стерилизацию проводят в стерильных химических стаканах, накрытых чашками Петри. Очищенный и промытый растительный материал в боксе на несколько секунд или 1-2 мин помещают в стакан с 70% спиртом, затем стерильным пинцетом вынимают и переносят в стерилизации (табл. 3), после которого отмывают в 3-5 порциях стерильной дистиллированной воды.