Калюс - ткань, возникшая в результате неорганизованной пролиферации клеток органов растений.
В природе Калюс образуется в результате дедиференциации паренхимных клеток в ответ на ранение.
Образование и рост каллуса регулируются ауксинов и цитокининов. С помощью этих веществ можно индуцировать образование каллуса в тех тканей растения, которые не образуют его в ответ на ранение. Существуют новые представления, согласно которых ауксины и цитокинины, а полисахариды и какие-то другие индукторы вызывают деления, в результате которого образуется Калюс.
Переход клетки in vitro с дифференцированного состояния к дедиференциации и активных клеточных делений обусловлен изменением активности генов (эпигенетической изменчивостью). Включение одних генов и репрессированию других приводит к изменению белкового состава клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа.
При переходе дедиференцийованои клетки к неорганизованного анархического размножения, которое приводит к образованию каллусных ткани, в клетках происходят биохимические и цитологические изменения. Дедиференциация начинается с использования запасных веществ и разрушение специализированных клеточных органелл. Через 6-12 ч после индукции дедиференциации клеточная стенка разрыхляется и разбухает, увеличивается количество свободных рибосом, возрастает количество элементов аппарата Гольджи, увеличиваются размеры и количество ядрышек. Все эти изменения предшествующих началу разделов, которые начинаются через 48-72 час.
После индуцирования образования каллуса в асептических условиях его отделяют и помещают на поверхность агаровой питательной среды. В результате этого получают стерильную каллусных культур или ткань, которая является основным типом растительной ткани, что культивируется. Впервые Калюс был получен из корня моркови Р.Готре в 1938 году.
На сегодня каллусных культур индуцируются практически из любого органа и ткани растений (листьев, стеблей, корней, цветоносов, частей цветка) и даже таких специализированных тканей растений, как эндосперм семян или микроспоры изолированные из пыльников. Однако простота этого процесса зависит от вида растения и ткани. Способность образовывать Калюс в условиях in vitro у молодых, ювенильных, растений выше, чем у зрелых. В случае специализированных тканей, например эндосперма, образование и рост каллуса зависят от возраста семян. Как правило, Калюс плохо образуется на эксплантаты старших 8-11 суток после опыления. Отрезки стебля древесных растений обычно являются плохими эксплантаты для получения каллуса.
Стоит отметить, что для успешной инициации первичного каллуса в питательную среду часто необходимо добавлять антиоксиданты (глютатион - 5 мг / л, диэтилдитиокарбамат - 5, цистеин - 5, аскорбиновую кислоту - 5, поливинилпирролидон - 250-500 мг / л и др.), будут ингибировать ферменты, окисляющие фенолы. Продукты окисления фенолов токсичны и подавляют деление клеток эксплантаты.
При получении первичного каллуса эксплантаты лучше культивировать на нескольких средах с различным соотношением ауксинов: цитокининов (табл. 4). Успех получения каллуса в значительной степени зависит от подбора регуляторов роста, индукторов клеточного деления.
С ауксинов чаще всего используют 2,4-Д или ИОК, которая имеет меньшую активность. Для индуцирования калюсогенезу соотношение ауксинов в цитокининов в питательной среде должно быть 10:1.
Для получения каллуса клетки специализированных тканей при помещении на питательную среду должны дедиференциюватися. В большинстве случаев клетки переходят к специализации из фазы G1, которая предшествует S-фазе - фазе синтеза ДНК, реже из фазы G2. Довольно часто эксплантаты, который используют для получения каллуса, содержит ткани, клетки которых по разному дифференцированы. Разное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности каллусных ткани, так как некоторые функциональные особенности дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений, как устойчивые модификации. Однородность исходной ткани имеет особое значение для злаков.
В двудольных растений каллуса легко образуются на эксплантаты различных органов: из семян, прорастающих в асептических условиях, сегментов стебля и корней, изолированных фрагментов паренхимы клубней, изолированной сердцевины стебля, с листа, органов цветка, зародышей, плодов и т.д.
Для получения каллуса голосеменных целесообразно использовать, как исходный материал, почки, которые растут, стерильные проростки, фрагменты флоэмы. Каллуса злаков получают из зародышей, мезокотиль, корней или отрезков основания стебля. Основная проблема получения каллуса злаков связана со сложностью выделения из этих растений эксплантаты, состоящий из однородной ткани и имеет оптимальный, достаточный размер. Первая каллусных культур злаковых получена из эндосперма кукурузы в 1949 году.
На сегодня разработаны условия получения каллуса ряда злаковых культур. Так, Калюс ржи получили из изолированного корня, Калюс ячменя - из зародыша, а суспензионную культуру - из отрезков корня проростков, Калюс черта - из узлов стебля, отрезков корней, побегов, овса - из семян, прорастающих, пшеницы - с семядольных узлов и зародыша.
Основной особенностью сред для калюсогенезу у злаков и дальнейшего культивирования каллуса является высокое содержание ауксинов, чаще 2,4-Д (до 10 мг / л). ИОК обычно используют в высокой концентрации, чем ее синтетический аналог. Оптимальная концентрация ИУК для злаков достигает 100 мг / л. Исключением является Калюс эндосперма кукурузы, который растет на среде без ауксинов, так как способен их синтезировать.
Процесс калюсоутворення зависит от размеров эксплантаты - обычно это 5-10 мм3. Для многих эксплантаты обязательно соблюдать физиологической полярности. Каллуса можно выращивать очень долго. Для этого необходимо каждые 3-4 недели пересаживать часть образованных клеток на свежий питательную среду. "Старым" считают штамм клеток, полученный из корнеплода моркови Роже Готра еще в 1938 году, и сегодня выращивают во многих лабораториях мира.
В цикле выращивания каллусных клетки после ряда разделов проходят обычный для растительной клетки онтогенез, они переходят к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусных клетки и наконец отмирают.
Каллусных ткань представляет аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным.
В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусных ткани бывают:
1) рыхлыми, сильно оводнен, рассыпчатыми;
2) средней плотности, или компактными с меристематических зонами;
3) плотными.
Консистенция каллуса зависит, в значительной степени, от состава среды: на средах с ауксинов, особенно 2,4-Д, каллуса становятся пухлыми. С рыхлых каллуса очень легко получить суспензионную культуру при помещении их в жидкую среду. С компактных каллуса можно получить пухлые, но не наоборот. Наибольшая способность к морфогенеза характерна для компактных каллуса, медленно растут.
Рыхлые и плотные каллуса отличаются анатомически: плотные каллуса менее дифференцированные содержат много вакуолизирован клеток, плотно упакованы. Кроме того, в плотных каллуса общее количество полисахаридов клеточной стенки выше, но содержание целлюлозы по сравнению с пектиновыми веществами и гемицеллюлозами занижен.
Каллусных ткани используют для сохранения в растущей состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, из них получают клеточные суспензии, которые культивируют в жидкой питательной среде, для регенерации растений.