Криобиология (от греческого kryos - холод, мороз, лед) - раздел биологии, изучающий действие на живые системы низких сверхнизких температур (от 00 С до абсолютного нуля).
Как наука криобиология начала развиваться в конце XIX века.
Криозбереження буквально означает сохранение в замороженном состоянии. Это сложный многоэтапный процесс, целью которого является неограниченное длительное хранение жизнеспособных клеток, меристем или органов растений в состоянии холодового анабиоза. Однако на практике обычно это хранение при очень низких температурах: при температуре сухого льда (- 74 ° С), в морозильниках с ультранизким температурой (- 80 ° С и ниже), в жидком азоте (- 196 ° С) или его парах (« - 140 ° С).
Главное преимущество хранения при очень низких температурах заключается в способности значительно замедлять или даже останавливать метаболические процессы и биологическое разрушение. Кроме того, материал, который сохраняется при низких температурах, остается генетически стабильным, и в этом случае, можно избежать генетических изменений, которые присущи организмам, поддерживаются обычными способами.
Криозбереження способствует также заметной экономии затрат на оборудование и зарплату персонала, а также уменьшает риск потери ценного материала вследствие загрязнения, ошибок или неисправности оборудования.
Для большинства соматических клеток и спермиев ряда видов криоконсервация стала обычной процедурой. В то время как для растительных клеток все еще нет универсального метода, который был бы пригоден для их криозбереження. Более того, как правило, даже штаммы, производные от одного исходного, требуют различных условий на некоторых важных этапах этой экстремальной процедуры. И все же в мире достигли криозбереження (при - 196 ° С) культур клеток почти для 40 видов растений и культур апикальных меристем еще 25 видов.
Причина такого относительно медленного продвижения связана не только с недостаточным вниманием к этой проблеме, но прежде всего со спецификой растительных клеток: большими размерами, значительной вакуолизацией, большим количеством воды и чрезвычайно широкой пластичностью их метаболизма, поскольку они находятся в более меняющихся условиях, чем условия строгого гомеостаза внутренней среды, окружающей клетки животных. Поэтому выживание клеток после размораживания даже в лучших, редких случаях не превышает 60-70%.
Повреждения клеток при замораживании и последующем оттаивания зависят от образования льда внутри клеток и от их дегидратации. Опасно рост центров кристаллизации в крупные кристаллы (более 0,1 мкм), чьи грани разрушают ендомембраны. Скорость роста кристаллов сильно возрастает при увеличении степени переохлаждения воды. Полностью рост и перестройка кристаллов льда останавливаются в чистой воде только при - 140 ° С. Вот почему длительное хранение возможно только при более низких температурах.
Точка замерзания цитоплазмы ~ - 1 ° С, криопротекторы снижают ее до - 3,5 ° С, но клетки, как правило, не замерзают до - И0-15 ° С, так как при этих температур плазмалемме еще предотвращает проникновение внутрь кристаллов льда, которые растут во внешнем растворе. Так что на момент инициации кристаллизации в клетке уже существует значительное переохлаждение, весьма неблагоприятно. Но если температура снижается достаточно медленно, то свободная вода успевает выйти из клетки. Происходит значительная дегидратация и сжатия протопласта, т.е. плазмолиз. Повреждения, возникающие могут иметь различные механизмы, но ведущую роль для клеток растений, если в середине них не образуются крупные кристаллы льда, при понижении температуры до - 25 ° С играет избыточный плазмолиз и последовавшая полная потеря осмотической реактивности в результате нарушения целостности плазмалемме.
Криозбереження как система единого экстремального процесса (замораживание-хранение-размораживание) состоит из следующих элементов: подготовка объекта, добавления криопротекторов, замораживание в определенном режиме, хранения в жидком азоте, размораживание, удаление криопротекторов (отмывка), рекультивация (для клеток), регенерация целых растений. Криоконсервация культур клеток и меристем растений в отличие от клеток животных во многих случаях начинается с этапа специальной подготовки, хотя есть культуры, для которых он не обязателен. Но и такие культуры для замораживания следует принимать в начале или середине экспоненциальной фазы роста, когда они обогащены меристемоиднимы клетками. Отсюда простой способ подготовки заключается в частом пересадке культуры, что позволяет поддерживать ее почти постоянно в ранней экспоненциальной фазе. Иногда пересадки делают каждые
2 - 4 суток.
Другие способы требуют предварительного культивирования в определенных условиях. При одном из способов в среду добавляли маннит или сорбит в концентрации 2 - 6% в период от нескольких дней до 2 - 3 пассажей. Таким образом уменьшал размер клеток и, что важнее, их вакуолей, значительно улучшал выживаемость клеток явора, моркови, перца, обеспечивал криозбереження многих штаммов. Иногда концентрацию сорбита повышают до 1 М (18,2%), но не более чем на сутки.
При втором способе передкультивуванння используют аминокислоты и в первую очередь пролин, который имеет значение для связывания воды в клетках растений. Его концентрацию постепенно повышали для ряда клеток до 1 М (11,5%) на срок до 4 суток. Но клетки некоторых видов очень чувствительны к пролина, даже при кратковременном (1 - 2 ч) инкубации. Например, для клеток диоскореи использовали низкие концентрации (0,01 - 0,05 м) и не только пролина, но и аланина, серина и аспарагина течение 4 - 6 суток. Наилучшие результаты были получены с аспарагин, другие аминокислоты были менее эффективны. Показано, что вместо пролина или вместе с ним у ряда видов растений значительная роль в осморегуляции принадлежит аспарагина или глицина. Кроме названных веществ для предварительного культивирования и криозащиты использовали Y-аминомасляной кислоты.
Третий способ передкультивування - добавление в среду криопротекторов - веществ, которые связывают свободную воду как в межклетниках, так и в клетках; усложняют ее кристаллизацию за счет образования с ним водородных связей; уменьшают уплотнения протопластов клеток при замораживании.
Эффективными криопротекторов является диметилсульфоксид (ДМСО), этиленгликоль и его производные, пролин, глицерин, сахароза и глюкоза. Кроме того, есть сообщения о криозащитной действие и других (кроме пролина) аминокислот и близких соединений (глицин-бетаин, Y-аминомасляная кислота, оксипролина и аспартат). Все эти вещества используют как отдельно, так и в комбинациях, что позволяет уменьшить их токсичность. Например, ПЭГ со средней мол. массой 6000 действует именно таким образом, поскольку сам не защищает. Редко как криопротектор используют трегалозы, которая в концентрации 15% оказалась в 1,5 раза эффективнее, чем 7%-й ДМСО, а 20% - почти на уровне ДМСО. Особенно эффективным было использование смеси трегалозы с ДМСО и сахарозой.
Сначала этот способ передкультивування использовали только для апексов побегов.
Для передкультивування с криопротекторов следует использовать жидкую среду и мостики с фильтровальной бумаги.
Четвертый способ предварительного культивирования происходит в условиях искусственного закаливания, его лучше применять для зимующих растений умеренного климата. Для клеточных, тканевых и органных культур не зимующих растений этот способ неприменим. При культур меристем целесообразно предварительно закалять сами растения из которых затем вырезают меристемы и культивируют их на среде с ДМСО. Суть закаливания заключается в имитации естественного осеннего процесса подготовки растений к периоду зимнего покоя. У разных групп растений цитофизиологични механизмы такой подготовки разные. При работе с клеточными суспензионного или каллусных культур обычно их или сразу помещают в условия с температурой от 2 ° до 5 ° С на срок от 1 до 6 недель, или сначала в течение нескольких суток выдерживают при температуре 8-10 ° С. Эффективнее закаливания в присутствии сахарозы. Для каллусных культур ее добавляют до 12 - 15%.
Для пред-и рекультивування растительных тканей используют среду Мурасиге и Скуга (МС) с 2% сахарозой, витаминами за стаб, инозитом - 100, кинетином - 0,5, гибереловою кислотой - 2, аденином - 40 мг / л.
Выбор способа подготовки зависит от объекта и его особенностей. После подготовки перед добавлением криопротекторов клеточные суспензии концентрируют. Поскольку центрифугирования (даже в течение 5 мин при 100 g) повреждает много растительных клеток, то используют осаждение в цилиндре или прямо в колбе, которые помещают в сосуд со льдом. Продолжительность осаждения 15 - 20 мин в зависимости от размера клеток и их агрегатов. Небольшие агрегаты с мелкими наиболее жизнеспособными клетками оседают последними. После осаждения супернатант отсасывают.
Для мелких и устойчивых клеток (например, моркови) допустимые скорости замораживания 1 - 4 ° С / мин, но для больших и вакуолизирован, к которым относится большинство растительных клеток, культивируемых in vitro, рекомендуется скорость 0,5 ° С / мин, а для самых крупных агрегатов и апексов еще меньшие скорости. Аппараты программного замораживания выпускает Специальное конструкторское бюро при Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины в Харькове.
Сегодня создана универсальная программа замораживания, которая обеспечила успех с 13 клеточными штаммами 6 видов растений и меристемы трех видов. Основное отличие этой программы - это использование "затравки", т.е. принудительной инициации кристаллизации. Затравки должна быть при температуре на 1-2 ° С (не более) ниже точки замерзания криозащитной раствора. Для затравки ампулы погружают в жидкий азот на 0,5-1 , 0 сек (в камере заморожувача).
После затравки целесообразно стабилизировать температуру на том же уровне до кристаллизации всего раствора в ампулах. Для этого достаточно 20 мин. Далее снижают температуру с заданной скоростью до -30 0С, а затем со скоростью ~ 9 ° С / мин до -70 ° С и быстро переносят ампулы в жидкий азот. Именно при этой конечной температуре медленного замораживания получают максимальное выживание растительных клеток.
Продолжительность хранения в жидком азоте не лимитирована при условии, что ампулы не выступают над его поверхностью, так как температура над ней быстро повышается. Оттаивания должен быть как можно более быстрым. Для этого ампулы встряхивают в воде с температурой 40 ° С, иногда даже 60 ° С.
Отмывка от криопротекторов применяют только в случае веществ, токсичных для данных клеток. Содержимое ампулы разбавляют в 3-4 мероприятия с 15-минутным интервалами большим объемом холодного питательной среды или 3-15% сахарозой. Затем клетки просто отстаивают, а супернатант заменяют на питательную среду, объем которого примерно равен исходному объему суспензии.
Самый простой и вполне удовлетворительно оценки жизнеспособности клеток после размораживания - окрашивание приветственным красителем. Для этого смешивают каплю суспензии и каплю 0,1% феносафранина или 0,25% синего Эванса. Рассматривать под микроскопом можно сразу, окраски мертвых клеток устойчивое не менее 30 мин (живые клетки не окрашенные). При использовании флюоресцеюючого красителя флюоресцеиндиацетату, наоборот, не окрашенные мертвые клетки, но в этом случае рассматривать можно через 6 минут, окраски менее стабильное и нужен люминесцентный микроскоп. В связи с тем что основная масса клеток в основном сосредоточена в агрегатах с числом клеток более 10-15, где клетки маскируют друг друга и посчитать их невозможно или сложно, то рекомендуют при подсчете агрегатов, считать агрегат живым, если 1/2 и больше его клеток не окрашены, и мертвым если более половины клеток окрашены. Другие способы оценки имеют свои преимущества, но требуют больше времени и не повышают точность. Конечным критерием является четкое возобновление роста при рекультивуванни размороженных объектов. Для этого следует распределить суспензию из одной или двух-трех ампул на поверхности агаровой питательной среды. Восстановление культур требует от 2 до 6 недель.
Изучение жизнеспособности клеток после криоконсервирования показало, что хранение в жидком азоте не влияет на выживание и восстановление клеточных культур после криозбереження. Например, жизнеспособность клеточных линий диоскореи не изменилась после хранения в жидком азоте в течение 4,5 лет (штамм ДМ-0, 5) и 6 лет (штамм Д-1). Клетки моркови возобновили рост после 12 лет криозбереження. Уже получены растения-регенерантов картофеля, моркови, гороха, клубники, томатов из меристем, которые хранились при сверхнизких температурах. Проводятся исследования по криозбереження клеточных штаммов-продуцентов экономически важных веществ.
Контрольные вопросы и задания
1. Что такое криозбереження и каково его значение?
2. Назовите особенности растительных клеток, которые затрудняют разработку универсальных методов их криозбереження.
3. Что такое криопротекторы?
4. Назовите наиболее эффективные криопротекторы.
5. Какие скорости замораживания растительных объектов?
6. Какова продолжительность хранения в жидком азоте замороженных растительных объектов?
7. Назовите способы оценки жизнеспособности растительных клеток после размораживания.