На сегодня разработан ряд различных способов биотехнологии микроклонального размножения. В их основе лежат четыре принципиальных подхода:
1) активация развития растительных меристем (апекс побега, пазушные и спящие почки побега);
2) образование адвентивных почек из тканей эксплантаты;
3) индукция соматического эмбриогенеза;
4) дифференциация адвентивных почек в первичной и перевивний каллусных ткани.
Иногда, как отдельную модель выделяют культуру пыльников.
Основным методом микроклонального размножения растений является активация пазушных меристем. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур. Эта модель является наиболее надежной по плодовых и ягодных растений. Впервые эта модель была разработана на землянике в начале 70-х годов прошлого века. Этот метод базируется на снятии апикального доминирования, чего можно достичь двумя путями:
1. Получением побегов нормальных пропорций с последующим их разделением на "однобрунькови микроживци", которые используются как вторичные эксплантаты для повторения цикла размножения. Теоретическая возможность такого способа размножения составляет примерно 10 000 - 1 000 000 побегов в год.
2. Введением в питательную среду веществ с цитокининовым активностью, что приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки дают начало новым побегам. Эксплантаты на таких средах приобретают вид пучков маленьких побегов, каждый из которых можно рекультивировать. Теоретически, возможность этого метода может составлять до 15000000000 почек или побегов в год от одного эксплантаты. Считают, что этот метод имеет минимальную степень риска относительно получения неоднородного потомства и частота появления мутантных растений не превышает частоты появления таких при обычном размножении. Метод относительно универсальный и имеет хорошую воспроизводимость в пределах вида и даже рода растений.
Второй метод - это индукция образования адвентивных почек непосредственно тканями эксплантаты. Он основан на способности изолированных частей растений при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и регенерировать целые растения (исключение составляет корневой органогенез). Почти все органы и ткани растений могут образовывать Адвентивная почки. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих только цитокининов или в сочетании с ауксином в соотношении 10:1 или 100:1. С ауксинов в этом случае чаще всего используют ИОК или НОК.
Этим путем можно размножать нарциссы, лилии, гладиолусы, чеснок, лук, цветную капусту, землянику, малину, яблоню, грушу и другие.
Однако, некоторые исследователи считают, что при размножении таким способом не исключена возможность получения неоднородного потомства. Дело в том, что в тканях эксплантаты могут быть клетки с нарушенной плоидность. Прежде всего это касается тканей, состоящих из клеток, быстро отмирают, например, клетки корневого чехлика. И хотя вероятность регенерации растений из таких клеток относительно низкая, ею нельзя пренебрегать, так как in vitro эти клетки могут получить преимущество в развитии.
В некоторых случаях эффективным способом размножения растений in vitro может быть соматический эмбриогенез - это формирование зародкоподибних структур (эмбриоидов) из соматических клеток в условиях in vitro, которые при переносе на соответствующее питательную среду способны развиваться в целое растение. Соматический эмбриогенез наглядно демонстрирует тотипотентность растительных клеток.
Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуальных вне зародышевым мешком и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, в которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. В некоторых случаях эмбриоидов образуются непосредственно из клеток ткани, культивируемой in vitro, - это так называемый прямой эмбриогенез. В других случаях сначала формируется Калюс, а уже из него развиваются зародыши-это косвенный эмбриогенез.
Эмбриоидов образуются из одиночных клеток, расположенных в основном на поверхности каллуса. Они отличаются плотной цитоплазмой, относительно большим ядром с увеличенным ядрышком, содержат мелкие вакуоли. Это метаболически активные клетки, богатые белками и РНК. Окружающие вакуолизирован клетки выполняют функцию "ткани-няни".
Формирование эмбриоидов в культуре тканей проходит в два этапа. На первом этапе клетки эксплантаты дедиференциюються за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-Д и превращаются в эмбриональные. На следующем этапе из этих клеток развиваются эмбриоидов. Происходит это при уменьшении концентрации ауксина или вообще полного его исключения из состава питательной среды.
Эмбриогенез легче происходит у молодых культурах. По мере удлинения срока культивирования ембриогенна активность клеток ослабляется. Так в моркови эмбриоидов начинают образовываться через 4-6 недель после получения каллуса, оптимальный возраст культуры для индукции соматического эмбриогенеза - 1520 недель 30-40-недельная культура часто теряет ембриогенний потенциал.
Четвертый метод микроклонального размножения - дифференциация адвентивных почек в первичной и перевивний каллусных ткани. Этот метод мало используется для получения посадочного метериала in vitro. Это связано с тем, что при длительном культивировании каллуса наблюдаются изменения плоидности клеток, структурные перестройки хромосом, накопления генных мутаций и уменьшение или и потеря морфогенном потенциала. Поэтому этот метод микроклоноального размножения целесообразно использовать только для тех растений, для которых присуща генетическая стабильность каллусных ткани, а вариабельность между растениями-регенерантов не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести томаты, спаржу, некоторые древесные породы. Через каллусных культур были также размножены сахарная свекла, кукуруза, рис, пшеница, подсолнечник, лен, картофель, огурец.