Изолированный протопласт - это растительная клетка, лишенная клеточной стенки ферментативным или механическим способом.
Культура изолированных протопластов это один из самых современных методов, который используется в генетике, физиологии, вирусологии и молекулярной биологии для получения соматических гибридов между удаленными в систематическом отношении видами или при половой несовместимости, для получения новых форм растений путем введения в клетку чужеродного генома или его части .
Отсутствие оболочки облегчает поступление в клетку различных физиологически активных веществ и позволяет наблюдать за первичной реакцией клетки на воздействие этих веществ, исследовать метаболизм в контролируемых условиях. Так как в изолированных протопластов сразу начинается регенерация клеточной оболочки, то они очень удобным объектом для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл.
Протопласты высших растений можно получать механическим и / или ферментативным методом.
Впервые протопласты были выделены Клеркером в 1892 году при изучении плазмолиза из тканей листа водного растения телорез (Stratiotes aloides). Он сначала плазмолизував растительные ткани, а затем удалял клеточную стенку. Таким методом можно выделить протопласты с эпидермиса лука (в 0,1 М растворе сахарозы). Если после плазмолиза разрезать лезвием полоску эпидермиса, то протопласты будут выходить в среду, содержащего осмотическое стабилизатор. Такой метод выделения протопластов называются механическим или физическим.
Несмотря на модификации и усовершенствования механический метод и сегодня имеет определенные ограничения:
1) этим методом можно выделить только небольшое количество протопластов;
2) используются только те ткани, в которых происходит интенсивное плазмолиз, т.е. те которые имеют вакуолизирован клетки паренхимных типа;
3) метод длительный и трудоемкий, а потому сейчас используется очень редко.
Сегодня широко применяется ферментативный или химический метод выделения изолированных протопластов. В этом случае для разрушения клеточной стенки используются смеси ферментов. К первым работам по ферментативному выделению протопластов можно отнести опыты, в которых протопласты клеток гриба были изолированы в результате обработки клеточных стенок желудочным соком улитки Helix pomatia (1919).
Впервые протопласты из клеток высших растений энзиматическим методом выделил Кокинг в 1960 году. Он выделил протопласты из корешков проростков томатов, обрабатывая их гидролитическим ферментом (целлюлазой) с культуральной жидкости плесневых грибов Myrothecium verrucaria.
Ферментативный способ имеет большие преимущества, потому что он дает возможность получать значительные количества неповрежденных протопластов из любого органа или ткани, и сравнительно быстрый.
На сегодня протопласты получают из однодольных и двудольных растений, используя листья, побеги, колеоптиль, клубни, плоды, пыльца, каллусных культур. Для выделения протопластов, как правило, используют молодые растения. Предпочтение отдается растениям, которые выросли в стерильных условиях in vitro. В исследованиях ряда авторов (Хромова и др., 1984; Chaoxi et al., 1987; MC Tan et al., 1987) показано, что на жизнеспособность изолированных протопластов, и их способность к регенерации клеточной стенки, к разделов, образования микроколоний влияет физиологический состояние исходного материала, который определяется условиями культивирования. Кроме того, от физиологического состояния исходного материала зависела способность ткани к мацерации. Наилучшие результаты были получены при выращивании растений на среде с пониженным содержанием сахарозы (0,5%) и затмении растений перед выделением протопластов. Или при выращивании исходных растений при низкой интенсивности света (1500 - 2000 Лк) и коротком фотопериода (6 г). Исследователи объясняют увеличение количества жизнеспособных протопластов тем, что при слабом освещении или в среде с низким содержанием сахарозы резко снижается интенсивность фотосинтеза, в результате чего уменьшается содержание свободных сахаров и клетки синтезируют тонкую клеточную стенку, которая содержит меньше пектина. Относительно значения или влияния выращивания исходного материала при низких плюсовых температурах на выход изолированных протопластов, то данные противоположны: MC Tan (1987) отмечает увеличение количества изолированных протопластов при таких условиях, тогда как Хромова с сотр. (1984) отмечают, что снижение температуры в период культивирования исходных растений не приводило к повышению эффективности процесса получения жизнеспособных протопластов, активно делятся.
При выделении протопластов из культуры тканей (Калюс или клеточная суспензия) необходимо учитывать:
1) возраст исходной ткани в цикле выращивания: лучше использовать ткань, которая находится на стадии раннего экспоненциального роста, когда в популяции значительное количество клеток, которые способны начать разделение;
2) особенности роста ткани - для выделения протопластов лучше использовать рыхлую, недифференцированную ткань, которая образует небольшие агрегаты клеток при культивировании в жидкой среде.
Важное значение для успешного выделения жизнеспособных, нативных протопластов имеет подбор осмотического стабилизатора. С наличием клеточной стенки у растительной клетки связана регуляция ее водообмена. Как известно, сосущие силу формируют не только осмотические свойства клетки, но и тургорного давление. С увеличением количества воды в клетке возрастает тургорного давление и, соответственно, уменьшается ее сосущая сила. Процесс поступления воды в клетку прекращается полностью, когда тургорного давление становится равным осмотическому давлению. Таким образом, структурная организация клетки, которая включает протопласт и клеточную стенку, формирует саморегуляторные механизмы водообмена.
Поэтому для изолированных протопластов, лишенных клеточной стенки особое, очень важное значение имеют осмотические свойства среды выделения и культивирования. Как осмотические стабилизаторы используют сахара - глюкозу, сахарозу, маннит, сорбит, ксилозу и иногда ионные осмотикы - растворы солей Са02, KCl, Na2HPÜ4. Маннит используют чаще, чем сорбит так как он имеет слабую проникающую способность в клетки, проникновение в клетки сорбита сопровождается и проникновением ферментов. Используют смесь маннита и сорбита. Использование в ферментных системах растворов глюкозы и сахарозы создает условия близки к условиям культивирования, хотя эти сахара активно проникают через мембрану. В тех случаях, когда использование сахаров не дает хороших результатов, как осмотические стабилизаторы используют растворы солей. Хотя известно, что соли имеют большую проникающую способность, чем сахара, и снижают активность некоторых гидролитических ферментов. Растворы макро-и микросолей часто берут за основу которой добавляют другие физиологически активные вещества. Это смягчает процесс выделения протопластов. Особенно когда он длительный, и приближает его к условиям культивирования ткани в суспензии. Неправильный выбор осмотического агента может привести к разрыву плазмалемме или вызвать спонтанное слияния протопластов и образование многоядерных клеток. Оптимальным для выделения протопластов является 0,3 - 0,8 М растворы.
Для ферментативного разрушения клеточной стенки используют препараты трех типов - целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназу, получаемых из культур разных грибов (Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride, Aspergillus и др.), а также пищеварительного сока улитки Helix pomatia. Чаще всего используют целюлазни препараты "Onozuka", "Driselase" и препараты пектиназу - "Macerozyme", "Pectinase" или "Pectinol". Действие этих ферментов направлена на разрушение основных компонентов клеточной стенки. У растений это целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества. Целлюлозные молекулы, которые собраны в микрофибрилл, формируют рыхлый, но крепкий структурный остов. Он погружен в аморфный матрикс, состоящий из гемицеллюлозы, пектиновых веществ и белков.
В первичной клеточной стенке на долю целлюлозы приходится до 30% от сухой массы и столько же на пектиновые вещества, 40% составляют гемицеллюлозы. Эти соотношения могут варьировать в клетках разных типов ткани зависимости от функциональных особенностей, возраста, наличия вторичных утолщений. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их соотношение специфичны для каждого типа клеток. Так для получения протопластов из ткани плодов, которые обычно имеют высокое содержание пектина, особенно подходит пектиназу. Тогда как, при выделении протопластов с мезофилы листа следует использовать смесь пектиназу и целлюлазы - фермента, разрушающего целлюлозные компоненты клеточной стенки.
Оптимальные условия для выделения протопластов очень индивидуальны для разных тканей, а потому в каждом случае необходимо подбирать состав смеси ферментов, их концентрации и соотношения, а также продолжительность обработки. Выделенные протопласты должны контактировать с ферментом минимальное время, а затем их нужно тщательно отмыть.
Время выделения протопластов зависит от концентрации фермента. При больших концентрациях продолжительность инкубации составляет 1 - 4 ч, при невысоких -12 - 20 ч, оптимальные условия рН 5 - 6, температура 23 - 26 ° С. Иногда необходимо слабое покачивание течение инкубации с ферментом.