При изучении механизма этого процесса было установлено, что он ускоряется некоторыми дикарбоновых кислот, имеющих четыре атома углерода в цепи - янтарной, фумаровой, яблочной и особенно щавелевоуксусную
(щек, оксалоацетат). Было также замечено, что этот процесс значительно активируется трикарбоновых кислот, в частности лимонной, а количество последней увеличивается при добавления дикарбоновых кислот к гомогената мышечной ткани. Затем было доказано, что преобразование дикарбоновых кислот на трикарбоновых лимонную происходит вследствие реакции между ацетил-КоА и щавелевоуксусную кислотой. Постепенно выяснилось природу всех промежуточных продуктов и ферментных систем, участвующих в окислении ацетил-КоА до СО2 и Н2О в процессе аэробной фазы.
1. Цикл начинается с конденсации чотиривуглецевого компонента - щавелевоуксусную кислоты, и двовуглецевого компонента - а это-тил-КоА с участием молекулы воды с образованием активной формы лимонной кислоты и КоАБН. Углерод метильной группы ацетил взаимодействует с атомом углерода оксалоацетата (щек). Промежуточным соединением является цитрил-КоА, который гидролизуется с образованием свободного цитрата.
Гидролиз цитрил-КоА приводит к смещению суммарной реакции в направлении синтеза цитрата.
2. Лимонная кислота (цитрат), образовавшейся под влиянием фермента аконитатгидратазы дегидруеться и превращается в цис-ако-нитову кислоту, которая после присоединения молекулы воды превращается в изолимонну (изоцитрат). Как видно из формул, разница между лимонной и изолимонною кислотами заключается в том, что в лимонной кислоте гидроксил находится в □-положении, а в изолимонний - в □-положении относительно карбоксилу главной цепи.
Между тремя трикарбоновых кислот устанавливается динамическое равновесие в таком соотношении: цитрата 90%, изоцитрат -8%, цис-аконитату - 2%. В дальнейших преобразований привлекается изоцитрат; в процессе окисления его количество пополняется за счет изомеризации цитрата.
3. Следующая реакция является первой из четырех окислительно-восстановительных реакций цикла трикарбоновых кислот. Изолимонна кислота окисляется путем отщепления двух атомов водорода и превращается в щавлевоянтарну (ЩЯК, оксалосукцинат) кислоту, которая декарбоксилюеться к □ - кетоглутаровой. Таким образом, с переходом изолимоннои кислоты в щавлевоянтарну начинается окисление остатка уксусной кислоты, а декарбоксилированием ща-влевоянтарнои к □-кетоглутаровой кислоты - разрыв углеродной цепи и отщепления углерода в виде СО2. Обе реакции катализируемой одним ферментом - изоцитратдегидрогеназою. Этот фермент существует в двух формах, одна из которых НАД + - зависимая, другая-НАДФ +-зависимая.
Вследствие отщепления двух атомов водорода от изоцитрат НАД + и НАДФ + соответственно восстанавливаются до НАД ^ Н + Н + и НАДФЖ + Н +. Все описанные преобразования можно представить в виде следующей схемы. Следует отметить, что НАД-зависимый фермент локализуется в митохондриях, и атомы водорода от восстановленного НАД ^ Н + Н + далее переносятся по цепи дыхательных ферментов на кислород с образованием воды, т.е. процесс идет путем катаболизма. Вторая форма изоцитрат-дегидрогеназы (НАДФ-зависимая) находится преимущественно в цитоплазме, и атомы водорода ее восстановленной формы (НАДФ ^ Н + Н +), как правило, используются в процессах биосинтеза различных соединений (высших жирных кислот, холестерина, стероидных гормонов и др.) , т.е. процесс идет путем анаболизма.
4. Кетоглутаровая кислота по структуре подобна пировиноградной. Она испытывает такого же сложного окислительного дека-рбоксилювання под влиянием сложной полиферментные системы-2-оксоглутаратдегидрогеназы (□-кетоглутаратдегидрогеназы). Эта система, как и пируватдегидрогеназного, состоит из специфической белковой части - апоферментами и тех же коферментов (ТПФ, НБ-КоА, липоевой кислоты, НАД + и ФАД). Для этой реакции, как и для окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты, необходимы ионы Мg2 +. При этом выделяется вторую молекулу СО2 и отщепляются два атома водорода, которые связываются с НАД, образуя НАДРН + Н +.
5. Продукт этой реакции сукцинил-КоА относится к соединениям богатых энергию, и на следующей стадии цикла происходит перенос богатого энергию связи в сукцинильному тиоэфиры КоА в макроэргических фосфатных связей. Сукцинил-КоА реагирует с неорганическим фосфатом и превращается в сукцинилфосфат, а НБКоА высвобождается и может снова включаться в различные звенья обмена веществ. Сукцинилфосфат реагирует с гуанозиндифосфатом (ГДФ) и превращается в янтарную кислоту (сукцинат), а ГДФ, присоединяя фосфат, превращается в гуанозы-нтрифосфат (ГТФ). Таким образом, расщепление тиоефирного связи сукцинил-КоА сопряженное с фосфорилированием гуанозиндифосфату. Стоит обратить внимание на то, что во время окисления изолимоннои (трикарбоновых) кислоты в янтарную (дикарбоновых) отщепляется две молекулы СО2. Итак, окислилось два атома углерода, то есть столько, сколько было в уксусной кислоте.
6. Образована янтарная кислота (сукцинат) под влиянием фермента сукцинатдегидрогеназы окисляется в фумаровую кислоту. Акцептором водорода в этой реакции служит ФАД, а не НАД +, который используется в трех других окислительных реакциях цикла Кребса.
Молекула сукцинатдегидрогеназы содержит кроме Флавин четыре атома железа и четыре неорганических сульфиды. Гем в состав этого фермента не входит. Атомы железа связаны с неорганическими сульфидами. Белки такого типа известны как зализосиркопротеины (Fe-S-белки) или белки, содержащие негеминовых железо.