Вариабельные и стабильные участки. Как в легких, так и в тяжелых цепях существуют V-участок, в которой последовательность аминокислот является переменной (variable), и С-участок (constant), в которой во всех цепях
этого класса или типа определенного вида животных постоянно находятся те же аминокислоты. Начало постоянной части называют точкой переключения. Вариабельность в последовательности аминокислот цепей иммуноглобулинов обеспечивает возможность существования антител различной специфичности. Стали части цепей, общие для одного класса антител, предопределяют общие свойства: способность связывать комплемент, фиксироваться на клеточных рецепторах, проникать сквозь плаценту. Вариабельны участки тяжелых и легких цепей имеют примерно одинаковую длину и по структуре более сходны между собой, чем к постоянным участков собственных цепей. V-участок легких цепей содержит 107 - 112, а V-участок тяжелых - 114 - 124 остатки аминокислот.
Несмотря на вариабельность NH2-концевых половин легких цепей, к-цепи разделяют на 4, а Х-цепи - на 5 подгрупп. В каждой из подгрупп сходство последовательностей по составу аминокислот достигает 80%, а между подгруппами - 50%. В рамках вариабельных частей легких цепей за стабильностью их состава обнаружены три типа участков: консервативные с постоянным составом аминокислот, вариабельны, в которых размещены участки, характерные для этой группы; гипервариабельные, в которых замены происходят довольно часто. Разнообразие антител обеспечивается прежде всего за счет многообразия последовательностей в гипервариабельные области. Активный центр антитела формируется остатками аминокислот гипервариабельных участков. Основу его составляют гипервариабельные области Н-цепей, а легкие цепи обеспечивают «тонкую настройку». Это позволяет тому же активному центру связывать, хотя и с разной степенью аффинности, не только специфические, но и структурно подобные эпитопы.
При изучении миеломных белков человека в различных лабораториях было выяснено, что относительно постоянными частями V-участка тяжелых цепей являются следующие положения, которые выполняют роль каркасных структур: 1-30, 38-50, 69-83, 92-100, 111 -124. Все изученные белки по характеру аминокислотных последовательностей разделили на три подгруппы.
Оказалось, что в V-области около 65% аминокислот тяжелых цепей имеют ограниченную изменчивость, а 20% аминокислотных последовательностей абсолютно стали, независимо от того, к какой из подгрупп они принадлежат. Постоянными были остатки аминокислот в таких положениях: 2, 4, 8, 14, 22, 25, 26, 38, 40, 43, 47, 48, 49, 69, 79, 92, 93, 94, 96, 98, 117, 120, 122, 123. Положение 3, 9, 17, 19, 21, 23, 28, 29, 39, 42, 46, 50, 80, 81, 82 были специфичными для подгрупп. Различия в степени вариабельности также и внутри подгрупп. Так, вторая гипермутабельна участок более вариабельна в положениях 51 - 60 для второй подгруппы, тогда как первая подгруппа - более вариабельна в положениях 61-65. Больше вариабельность оказывается внутри гипервариабельных участков в третьей подгруппе. С 28 остатков аминокислот этой подгруппы 21 отличался своим положением. В отношении маловариабельний части V-участка третьей подгруппы идентичными были 91 из 95 положений, тогда как в гипервариабельные - только 7 из 28. VH-подгруппы могут находиться в ассоциации с Сн участками тяжелой цепи любого класса имуногло Булин.
Константные положение как в Vh-, так и в VL-участках связанные с обеспечением функционального взаимодействия субъединиц молекулы, например жесткости или взаимодействия между цепями. Глицин в положении 3 в Fab-фрагмент IgG к белку New обеспечивает вращение фрагмента между Vl-Vh. Фенилаланин в положении 99 и триптофан в положении 107 VH-участка участвуют в мижланцюговому контакте.
В к-цепях человеческого и мышиного белка Бенс-Джонса выявлено 44 одинаковых остатки аминокислот, что свидетельствует о достаточно высокой консервативности этих структур в процессе эволюции. Замены аминокислотных последовательностей есть и в постоянных частях легких и тяжелых цепей, однако в отличие от замен в вариабельных участках они единичны и стабильны.
В V-области к-цепей около 70% положений вариабельны, тогда как в С-области к-цепей вариации есть только в положении 191, где может находиться валин или лейцин. Аналогично С-участок Х-цепей имеет две замены в положении 190 - Лиз-Арг. Однако в отличие от положения 191 в к-цепях эта замена не наследуется, а тот же организм может синтезировать Х-цепи, содержащие как Лиз, так и Арг, т.е. С-участок Х-цепей кодируется двумя структурными генами. Гомология вариабельных и константных участков легких цепей составляет 15%, а гомология константных участков цепей к и Х - 40%.
Горячие точки. Точки, в которых замена аминокислот происходит чаще, чем в других положениях, называют гипермутабельнимы, или горячими точками. В легких цепях мышей и человека гипервариабельные есть 26-32, 48-55, 90-95, а в тяжелых - 31-37, 51-68, 84-91 и 101-110 аминокислотные остатки. Анализ причин вариабельности свидетельствует о том, что около 70% замен обусловлены изменением одного нуклеотида триплета, около 25% - двух нуклеотидов и незначительное количество - изменениями всего триплета, т.е. изменчивость последовательности аминокислот в легких цепях является следствием точечных мутаций.
В горячих точках замены часто происходят той же аминокислотой, из чего можно сделать вывод, что они не случайны, а закодированные в структурных генах. Итак, легкую цепь кодируется большим количеством генов. Стимуляция определенного клона лимфоидных клеток антигеном приводит к «возникновения» всех С-генов, кроме одного, который, сочетаясь с одним из многих V-генов, образует VC-ген, регулирующий синтез специфического полипептида. Система из множества генов обеспечивает высокую пластичность адаптации в зависимости от изменения условий существования организма.
В вариабельных участках как тяжелых, так и легких цепей было обнаружено каркасные детерминанты. Каркасными называют относительно инвариантные части V-участка, которые не включены в гипервариабельные структуры и занимают около 80 - 85% всего участка. Каркасные участки создают стабильную пространственную структуру, которая обеспечивает определенное размещение остатков аминокислот, от которых зависит комплиментарность к антигену. Изменчивость каркасных участков составляет менее 5%. Они имеют одинаковые размеры и расположены в легких и тяжелых цепях различных иммуноглобулинов и различных видов животных в тех же местах. Они также идентичны в антитело любой специфичности у животных одного вида.
Шарнирная участок. Показано, что тяжелые цепи молекул под влиянием протеолитических ферментов расщепляются в определенном месте (посередине тяжелой цепи), соединяющий СН1-и С "2-домены или Fab-и Fc-фрагменты (см. табл. 24). Эта шарнирная часть молекулы, которую называют талией, не вторичной и третичной структур. Это позволяет ей выполнять роль шарнира, а субъединицы молекулы - вращаться. Талия обеспечивает гибкость молекулы между Fab-и Fc-фрагментами. Благодаря наличию шарнирной участка угол между Fab-фрагментами IgG может изменяться от 0 до 180 °. Каждый класс иммуноглобулинов имеет своеобразное строение шарнирной участка. Участок талии состоит из 15 - 60 аминокислот. Отрезок с 15 аминокислотных остатков может повторяться. В молекуле IgG3 он дупликований четыре раза. Шарнирная участок характеризуется высоким содержанием остатков цистеина, которая обеспечивает связь между Н-цепями через дисульфидные мостики. Кроме того, здесь содержится значительное количество остатков пролина. В области талии происходит расщепление полилептидного цепи папаином, пепсином, трипсином, плазмином, катепсина (см. табл. 24). Шарнирная участок влияет на конформацию и функциональную специфику Fc-фрагментов подклассов IgG и на свойства доменов СН2 и СН3. Она также участвует в образовании низкомолекулярных иммуностимулирующее факторов. Последние отщепляются протеазами фагоцитов из участков талии при взаимодействии молекулы антитела с антигеном и является «сигналом тревоги». Они усиливают фагоцитоз, антителозависимую цитотоксичность, активируют комплемент. Однако гомологии участка талии с доменами вариабельных и константных участков не выявлено. Поэтому сделано предположение о независимой эволюции гена, кодирующего этот участок.
Дисульфидные связи. В молекулах иммуноглобулинов есть три типа дисульфидных связей: 1) мижланцюгови дисульфидные связи между Н-цепями и между Н-и L-цепями, 2) мижланцюгови дисульфидные связи, обусловленные полимеризацией молекул IgM и IgA, 3) дисульфидные мостики внутри цепей - два в легком и четыре-пять в тяжелом (рис. 38). Дисульфидные связи, соединяющие Н-цепи между собой, размещенные в шарнирной области. Количество и положение дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных классов и подклассов антител неодинаковы. В первом и четвертом подклассах IgG между тяжелыми цепями по два дисульфидных связи, однако положение их разное. Так, IgG2 содержит четыре, a IgG3 - шесть-десять таких связей. В СООН-концевых положениях тяжелых цепей иммуноглобулинов различных классов дисульфидных связей нет. Цепи здесь соединены с помощью нековалентных связей двух типов. Дисульфидные связи образуются и между Н-и L-цепями. Легкие цепи сочетаются с остатками цистеина тяжелых цепей в положении 214 или рядом с остатком аминокислоты в положении 131. Тяжелые и легкие цепи Второй подкласс IgA дисульфидными связями между собой не соединены. Расщепление низкого рН дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями сопровождается образованием двух симметричных фрагментов, состоящих из Н-и L-цепей, которые могут реасоциюваты в нейтральной среде. Если тяжелые и легкие цепи разделить на две группы, a S-S-связи заблокировать йодацетамидом, то при смешивании они могут реасоциюваты за счет нековалентных связей, образуя спонтанно чотириланцюгови молекулы, которые по физико-химическим и антигенным свойствам подобные нативной молекулы.
Полимеризацию мономеров в пентамер в молекуле IgM обеспечивают дисульфидные связи благодаря сочетанию напивцистеинових остатков Н-цепей двух соседних мономеров или, возможно, через связь с J-цепью. Стабилизирующие дисульфидные связи также между Сц3-доменами. Дисульфидные связи внутри цепей «запирают» петли с 60 - 70 аминокислотных остатков, образуя домены, которые стабилизируют структуру молекулы и придают ей компактности. Промежутки между петлями примерно одинаковы (за исключением шарнирной участка), однако в вариабельных участках в петлях содержится большее количество остатков аминокислот.
Домены. Молекулы иммуноглобулинов состоят из компактных, плотно соединенных глобулярных участков - доменов, включающие от 100 до 110 остатков аминокислот, стабилизированные внутренними дисульфидными связями. В легких цепях как к-, так и Х-типов по два домены из 110 остатков аминокислот с одним внутришньоланцюговим дисульфидные связи, образующей петлю длиной около 60 - 70 аминокислотных остатков (по одной петле в вариабельных и устойчивых участках цепи). Тяжелую цепь IgG и IgA можно разделить на четыре домены - линейно соединены контактные участки, содержащие по 100 - 110 остатков аминокислот и один дисульфидная связь, образующая петлю. Глобулы С-доменов имеют форму цилиндров, образованные семью складками цепи и являются компактными структурами. В каждом V-домене есть девять продольных (S-) участков и восемь изгибов, обусловленных поворотами цепи. Домены соединены между собой полипептидные нитью подобно бусин так, что могут быть размещены под углом друг к другу. V-домены упаковываются таким образом, что их гипервариабельные участки, которые содержатся в разных местах полипептидной цепи, расположенные друг возле друга. Это позволяет им образовывать («выстелить») стенки полости активного центра.
Различия, наблюдаемые в структуре доменов, определяющих специфику их функции. В д-цепи один домен отвечает за распознавание антигена, второй образует структуру, комплементарная С-области L-цепи, третий - обеспечивает фиксацию комплемента, четвертый - связывается с клеточной поверхностью и приводит распознавания рецепторов клеток, пятый - обеспечивает связь вязки мономеров молекулы в сложные агрегаты. Гомологичные Vh-и VL-домены участвуют в образовании активных центров антител. Домены тяжелой цепи СН1, СН2, Ch3 сходны между собой по первичной структуре и к С-домена L-цепи.
Структурное сходство участков доменов легких и тяжелых цепей, возможно, обусловлено происхождением их от общего предкового гена вследствие дупликаций - двойной в локусе, контролирующий легкую цепь, и четырехкратной в локусе, контролирующий тяжелую цепь. Продукт исходного гена, очевидно, имел молекулярную массу 10 000 - 12 000. Возможно, что этим геном был ген бета2-микроглобулина. После первичной его дупликации возник ген легкой цепи, а после вторичной - ген тяжелой цепи, состоящей из четырех локусов. В процессе дальнейшей дивергентной эволюции возникли гены д-, у-, а-, 8 -, s-тяжелых цепей и к-, Х-гены легких цепей. Характер заключения V-доменов тяжелых и легких цепей такой, что при этом образуются две группы петель, из которых дистальные контактируют с С-доменом, а проксимальные остаются свободными, следовательно, доступными для растворителя. Свободные петли примерно соответствуют гипервариабельные участки легкого и тяжелого цепей. Эти участки расположены в активном центре антитела, остатки аминокислот, которые образуют, контактируют с антигеном. Однако антиген может контактировать и с остатками аминокислот, которые не входят в гипервариабельные области.
Междоменной участки цепей чувствительны к действию протеаз, чем домены. Под действием пепсина на Fab-фрагмента мышиного IgA отщепляются Cl-и Сн-домены, однако связь между Vl-и Vh-доменами сохраняется. Образован фрагмент называют Fv, причем он полностью сохраняет гаптензвьязувальну активность. СН1-и 0_-домены соединены между собой олигоцукриднимы цепями, содержащиеся между ними, образуя тандем.