Наиболее распространенным сейчас является метод сорбционного иммуноферментного анализа (ИФА)
, который на английском языке называется красивым словом ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Суть его заключается в том, что антиген сорбируют на поверхности лунки полистирольного планшета. Сорбция неспецифическая и идет по физико-химическим законам. Природа связей белков с поверхностью пластика до сих пор не выяснена.
Если антигена недостаточно, чтобы закрыть все потенциальные центры связывания, вторым шагом лунку блокируют нейтральным белком (например, сывороточным альбумином). Затем добавляют раствор, содержащий антитела. Антитела связываются с сорбированных антигеном, а те, что не связались, отмываются (специальным раствором или просто водой). Теперь необходимо выявить антитела, что связались. Для этого, как правило, используют вторую антитела (антитела против первых антител), меченые ферментом. Их тоже инкубируют в лунках, отмывают те, которые не связались, а затем добавляют раствор субстрата. Фермент начинает превращать его, и накопление окрашенного продукта пропорциональное количеству связанных других, а значит, и первых антител.
В такой постановке эксперимента тоже можно определять антиген. Если вместе с первыми антителами добавить растворимый антиген, то он будет конкурировать с сорбированных за связывание с антителами, и антител на твердой фазе свяжется тем меньше, чем больше добавлено растворимого антигена (рис. 6Б).
Для определения антигена распространен также так называемый сэндвич-метод, когда первые антитела сорбируют на пластик, добавляют пробу, содержащую антиген, а затем антитела к другой антигенной детерминанты антигена, также связываются с ним. Эти антитела могут быть мечеными сами по себе или быть проявленными второй мечеными антителами. Количество связанных "верхних" антител пропорциональна количеству антигена в пробе.
Использование второй антител имеет целью усиления конечного сигнала регистрируется в иммуноферментном анализе, и, соответственно, повышение чувствительности метода, поскольку с одной молекулой первые антитела может связаться несколько молекул меченых второй антител. Если использования второй антител по каким-либо причинам нежелательно, используют другие амплификацийни системы, например, белки А и G или очень популярную сейчас комплементарную пару авидин-биотин.
Авидин - белок куриного яйца, который имеет свойство прочно связывать витамин Н (биотин). Используют также стрептавидин, который добывают из стрептококком. Биотин легко присоединить к антителам, а обнаружить его наличие можно с помощью меченого авидин (стрептавидину). Метод можно усложнить, добавив еще один шаг: биотинильовани антитела, стрептавидин, биотинильована пероксидаза. Чем больше шагов, тем сильнее амплификация сигнала, но и тем больше потенциальных осложнений. В целом, иммуноферментные методы менее чувствительны, чем радиоиммунного, но в лучших образцах удавалось достичь сопоставимой чувствительности, особенно при использовании субстратов флуоресцують или имеют хемилюминесценции. Сейчас существует широкий выбор коммерческих продуктов, позволяющих выполнять любой вариант анализа. Разработанное специальное оборудование для быстрой обработки большого количества проб, многие процессы автоматизированы.
Принцип сорбционного ИФА используется не только в виде ELISA. Вместо полистирольного планшета может быть использовано другую твердую фазу, например нитроцеллюлозу, которая тоже специфично связывает белки. Метод в таком случае называется иммуно-дот (от английского dot - пятнышко). Использование нитроцеллюлозы как носителя позволило совместить иммунохимических методы с электрофорезом - в виде так называемого иммуноблота (Western blot). В таком случае антиген
33
разделяют на фракции электрофорезом в полиакриламидном геле, белки переносят на нитроцеллюлозу путем простой диффузии или электропереноса, а затем их проявляют антителами по тем же принципам, что и в ELISA. Отличие в том, что в случае иммуноблота используют другие хромогенные субстраты - те, которые дают нерастворимый продукт, который остается связанным с нитроцеллюлозой.
Как твердую фазу можно использовать шарики латекса, на которые сорбируют антиген или антитела. И, наконец, такие же подходы используются, когда антиген естественно связан с твердой фазой: на поверхности или внутри клеток. На таком принципе построены методы имуноцитохимии и проточной цитофлюориметрии.
Если антиген содержится на поверхности клеток, их обрабатывают антителами на холоде или после фиксации параформальдегид. Вторые антитела (или авидин или белок А) могут быть мечеными ферментом (тогда их наблюдают под микроскопом за появлением окраски), радиоактивной меткой (тогда количество связанных антител меряют счетчиком) или флюорохромом. В последнем случае клетки можно анализировать прямо под флуоресцентным микроскопом, или методом проточной цитофлюориметрии. Устройство, созданное для такого вида анализа, называется цитофлюориметр. Он имеет в своем составе лазер, в луче которого клетки и разделяются на те, которые светятся, и те, что нет. Их можно даже сортировать на отдельные популяции. Можно также заметить клетки сразу двумя или тремя (в последних случаях даже четырьмя) различными антителами, связанными с различными флюорохромами. Как правило, они возбуждаются светом одной длины волны, а излучающие в различных диапазонах. Так можно определять экспрессию в клетке сразу нескольких антигенов.
Для того, чтобы определить, какие антигены у клетки внутри, ее надо сделать проникло для антител (как правило, антитела внутрь клетки сами не проникают). Для этого клетки фиксируют смесью, содержащей этанол. Именно так можно увидеть под микроскопом плазматические клетки, наполненные антителами.
Чтобы идентифицировать клетки, которые секретируют антитела, используют модификацию ELISA, получившая название ELISPOT. В этом методе клетки выдерживают на нитроцеллюлозных фильтрах, покрытых антигеном. Секретируемых антитела связываются с антигеном вокруг клетки и после проявки второй антителами и субстратом проявляются как круга или пятна. Этот метод появился как упрощенный вариант метода локального гемолиза в геле, который был очень распространен еще десять лет назад. В том варианте клетки вносили в агарный гель, содержащий эритроциты (сами по себе или модифицировать антигеном). Антитела, что было секретируемого, связывались с эритроцитами, и после обработки комплементом в этих местах образовались зоны гемолиза эритроцитов - светлые пятна на красном фоне геля. (Именно таким методом было найдено гибридомы, секретувалы специфические антитела, в эксперименте Келера). ELISPOT тоже можно проводить в агаре в лунках полистирольных планшетов.
Таким образом, принцип иммунохимического анализа антигенов и антител имеет много модификаций и может быть использован для решения многих экспериментальных и диагностических задач. Для каждой конкретной задачи подбирают подходящую модификацию, исходя из потребностей чувствительности и возможностей идентификации конечного продукта.