Культура клеточных суспензий или суспензионные культура - выращивание отдельных или небольших агрегатов во взвешенном (взвешенные) состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, которая обеспечивает их аэрацию и перемешивание.
Суспензионные культура используется для изучения физиологических закономерностей роста, дифференциации, метаболизма соматических клеток высших растений. Особое значение имеет использование биосинтетического потенциала растительных клеток для промышленного получения при крупномасштабном культивировании ряда экономически ценных веществ - алкалоидов, стероидных соединений, глюкозидов, эфирных масел, ферментов и т.д..
Клеточную суспензию получают из кусочка каллуса в жидкой среде, которое перемешивается. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г свежей каллусных массы на 60-100 мл жидкого питательной среды. Первичную суспензию получают на круговом шейкере со скоростью перемешивания 100120 об / мин.
Суспензионную культуру можно получить также из фрагмента органа растения (листок, стебель, корень). Сначала на поверхности эксплантаты образуется первичный Калюс, а потом от него отделяются клетки и клеточные агрегаты, которые дают начало клеточной суспензии. Для получения высоко диспергированной суспензионной культуры большое значение имеет тип выходного каллусных ткани. Оптимальной является каллусных ткань рыхлого типа, легко рассыпается при внесении в жидкую среду, что перемешивается. Для этого Калюс выращивают на среде с высокой концентрацией ауксинов и уменьшенной концентрацией или без цитокининов и без ионов Са +. Добавление в среду фермента пектиназу, который разрушает пектаты кальция, склеивает отдельные клетки, облегчает получение суспензии.
Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к образованию каллусных ткани.
Первичную суспензионную культуру перед субкультивуванням фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от больших и плотных кусков каллусных ткани и крупных агрегатов.
Для глубинного культивирования растительных клеток пользуются способами выращивания, разработанные в микробиологии. Используют закрытые или открытые системы в периодическом или протоков режимах.
В закрытой системе при периодическом режиме выращивания клеточная масса помещается в определенный объем среды. До окончания выращивания система остается закрытой по всем параметрам кроме газов.
В закрытой непрерывной культуре в систему периодически подается свежий питательную среду, а старое удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего периода выращивания.
В открыт пролив культуры периодически поступает свежий среду, однако отбирается не только старое среду, но и часть клеточной массы. Регуляция этого процесса может осуществляться по принципу турбидостата или хемостата. В турбидостати подача свежего среды и отбор суспензии происходят после достижения клеточной суспензией определенной заданной плотности. Сигнал на включение поступает от реле, связанное с оптической системой, определяющей плотность суспензии. В хемостати скорость протока задается экспериментатором и от нее зависит скорость роста клеточной массы. Режим хемостата позволяет с помощью фиксированной скорости разбавления поддерживать постоянную скорость деления и плотность клеток в популяции. Распространенным режимом культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания суспензии используют различную аппаратуру: роллеры, шейкеры (как правило круговые), ферментеры с механическими и магнитными смесителями или ферментеры барботажного типа, в которых аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.
Для работы с суспензиями необходимо знать их характеристики: жизнеспособность, плотность клеток в суспензионной культуры, степень агрегированности, скорость роста.
Жизнеспособность клеток определяют по их окраске красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клетки не окрашиваются красителем так, как клеточные мембраны непроницаемы для него. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет.
Одним из основных показателей, характеризующих состояние клеточной суспензии, является плотность клеточной популяции. Количество клеток определяют в счетной камере Фукс-Розенталя под микроскопом после мацерации хромовой кислотой (10-20%).
Конечно пассаж культивирования клеточной суспензии составляет 14-16 дней. За это время плотность возрастает от 5104 до 5106 кл / мл.
Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток. Агрегаты не должны содержать более 10-12 клеток. Для удаления крупных агрегатов суспензии фильтруют через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позволяет избавиться от остатков эксплантаты или плотных кусков каллусных ткани.