Среда. Основное требование к сред заключается в том, чтобы в процессе культивирования не происходило разрушение изолированных протопластов, потому к образованию клеточной стенки протопласты - это очень нежные структуры, и чтобы оно было оптимальным для образования клетками колоний.
Как правило, среда должна состоять из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источников углерода, витаминов, источников органического азота и фитогормонов. Как осмотическое стабилизатор можно использовать маннит, сорбит и их комбинации. Состав минеральных солей соответствует составу минеральных солей в средах для культивирования клеток растений. Можно менять соотношение аммонийного и нитратного азота в зависимости от потребностей клеток, увеличивать концентрацию CaCh для стабилизации клеточной стенки формируется.
Качестве источника углерода используют глюкозу, сахарозу, их смесь. Сахароза не всегда может быть пригодным компонентом среды для протопластов. В некоторых случаях добавляют рибозу, ксилозу, фруктозу, маннозу и другие сахара.
В состав витаминов при культивировании изолированных протопластов должны входить тиамин HCl (В1), пиридоксин HCl (6) и никотиновая кислота (РР). При небольшой плотности высева необходимо добавлять и другие витамины.
Как источника азота к среде добавляют аминокислоты, чаще всего используют гидролизат казеина, который является смесью аминокислот и добавляют его в том случае, когда в среде недостаточное содержание неорганического азота, а его концентрацию уже нельзя увеличить.
Ауксины и цитокинины необходимые для клеточного деления и дальнейшего развития растительных клеток. Обычно используют 2,4-Д, НОК, кинетин, БАП, зеатин. Оптимальные концентрации фитогормонов подбирают в каждом конкретном случае.
Важное значение при культивировании изолированных протопластов приобретают и другие условия. Так, рН среды должна составлять от 5,4 до 5,8.
Температура, при которой культивируют изолированные протопласты варьирует в значительной степени в зависимости от вида. Так, для протопластов одного представителя злаков-росянки (Digitaria sanguinalis) оптимальной является температура 30 ° С, а для пшеницы 22 ° С. Большинство изолированных протопластов культивируется при температуре 24 - 26 ° С.
Что касается интенсивности света, то в большинстве случаев исследователи пришли к выводу, что свет высокой интенсивности пагубно влияет на изолированные протопласты. Но оптимальные значения освещенности варьируют в широких пределах. Так, люцерна образует колонии в абсолютной темноте (100 - 700 Лк), а для протопластов Nemesia strumosa (немезию - норичника) оптимальный рост наблюдали при освещенности 80 000 Лк.
Существенным фактором культивирования является плотность посева протопластов. При очень низкой плотности протопласты часто не делятся. С другой стороны, при очень высокой плотности трудности возникают на поздних стадиях, когда на рост могут влиять продукты обмена, выделяемые. Оптимальная плотность протопластов в культуре 104 - 106 пр / мл. Несколько компенсировать высокую плотность посева протопластов можно добавив к питательной среде активированный уголь.
В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в обычную клетку, которая культивируется in vitro. Именно это обстоятельство делает изолированные протопласты удобной моделью для изучения формирования целлюлозных микрофибрилл. Мелкие протопласты, полученные из меристематических тканей, начинают формировать стенку примерно через 1,5 часа после начала культивирования и через сутки клеточная стенка полностью покрывает протопласты. Протопласты из взрослых листьев имеют большие размеры и регенерируют стенку значительно медленнее: через 4 часа появляются первые очаги новообразования стенки, а через сутки стенка еще не образует сплошной покров.
Наблюдение за регенерацией клеточной стенки у протопластов скимии показали, что в этот период наблюдается сильное увеличение эндоплазматического ретикулума. Предполагают, что в шероховатых участках эндоплазматического ретикулума образуются ферменты, участвующие в синтезе предшественников целлюлозы.
В ходе регенерации целлюлозных компонентов клеточной стенки, можно выделить два периода:
Й период - синтез идет очень медленно и приводит к образованию небольшого количества целлюлозы;
ИИй период - начинается примерно через 8 суток после культивирования, и характеризуется резким увеличением (в 5 раз) скорости синтеза целлюлозы.
Заново синтезирована клеточная стенка не содержит пектиновые вещества.
Как правило, изолированные протопласты большинства видов растений через сутки образуют клеточную стенку, а через 2 - 3 суток происходит первое разделение. Второй раздел происходит на 7 - 8 сутки, затем образуется 8-клеточные колонии и на 21 - 30 сутки культивирования формируются многоклеточные колонии.
При переносе их на агаровой среде образуется Калюс, из которого можно получить целое растение. Регенерация растений происходит или через эмбриогенез, или из-за образования каллуса с последующей индукцией морфогенеза.