Уникальные биологические свойства Ти-плазмиды делают ее идеальным вектором для переноса генов. Она имеет широкий круг хозяев, встраивает ДНК в состав хромосомы, где она реплицируется и большая ее часть
транслируется с образованием белка. Однако из-за больших размеров (от 200 до 800 кб) манипуляции с Ти-плазмиды осложненные, вставить ген в плазмиду традиционными методами становится невозможным.
Несмотря на это сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Ти-плазмид организованы подобно и имеют следующие элементы:
- Селективный маркерный ген, например, ген неомицинфосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость трансформованних растительных клеток к канамицину,
- Сайт инициации репликации, позволяющий плазмиде реплицироваться в E.coli,
- Права фланкирующих последовательность Т-ДНК, которая необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений,
- Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в область между границами Т-ДНК.
Эти векторы не содержат онкогенных последовательностей, а потому после переноса с их помощью ДНК в ядро растительной клетки нормальный рост растения не нарушается. Но поскольку такие векторы не содержат генов vir, то они сами не способны обеспечить транспорт и интеграцию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Для решения этой проблемы разработаны два метода.
В первом случае для введения чужеродной ДНК используют коинтегративну векторную систему, которая предусматривает использование промежуточного вектора (Рис. 9).
Сначала Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в E. coli (например, pBR322). Плазмиду с Т-ДНК размножают и, используя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и снова размножают с уже вставленным геном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefaciens, которые несут полную Ти-плазмиду. В результате двойного кроссинговера (гомологической рекомбинации) между гомологичными районами Т-ДНК часть рекомбинантной плазмиды, содержащей чужеродный ген, включится в Ти-плазмиду, заменив в ней нормальную Т-ДНК. Наконец, бактериями, которые имеют Ти-плазмиду со встроенными генами, заражают растения и в результате получают клетки корончатого гала, которые будут содержать Т-область с встроенным в нее чужеродным геном.
Второй распространенный метод введения чужеродной информации заключается в использовании бинарной векторной системы. Бинарный вектор содержит инициации репликации и для E. coli, и для A. tumefaciens, но не содержит генов vir. Все стадии клонирования проводят в E. coli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens. Штамм-реципиент A. tumefaciens несет модифицированную Неонкогенные ("разоружения") Ти-плазмиду: она содержит полный набор vir-генов, но из нее удалена часть (или вся) Т-ДНК, так что Т-ДНК не может быть транспортирована. В этой системе на Неонкогенные Ти-плазмиде синтезируются продукты vir-генов. Производя белки, кодируемые vir-генами, Неонкогенные Ти-плазмида способствует встраиванию Т-ДНК из бинарного вектора в хромосомную ДНК растения. Распространен бинарный вектор-рBin19.