Первые эксперименты по генетической трансформации с использованием агробактерий проводили путем простого нанесения культуры бактерий на раневые поверхности растений. Опухоли, образовавшиеся переносили на
безгормонального питательные среды, содержащие антибиотики для элиминации бактерий. Этот способ был не очень удобным в работе, поскольку предполагал использование только онкогенных штаммов агробактерий, кроме того, значительное количество в тканях опухоли составили нетрансформовани клетки, растут за счет фитогормонов, которые выделяют трансформантов.
Современные методы переноса новых генов можно разделить на две группы. К первой группе относят методы введения генов с помощью естественных векторов (на основе Ти-, Ri-плазмид, вирусов и вироиды), а ко второй - прямые методы введения чужеродной ДНК в геном высших растений (прямая трансформация изолированных протопластов, микроинъекции, электропорация , упаковка в липосомы, биолистика и другие) (Рис. 10).
Среди методов первой группы чаще используют относительно простой и удобный метод "листовых дисков". Суть метода заключается в том, что из листьев растения нарезают полоски или диски. Их заражают Агробактерии и совместно культивируют на твердом или жидком средах. Сначала Агробактерии попадает в места повреждения и присоединяется к клетке. Контакт с поврежденной растением "включает" гены vir-и Т-области. Индуктором этих процессов является ацетосирингон поврежденных частей растения. Через 4-5 часов начинается перенос Т-ДНК Ти-плазмиды в клетку растения, заканчивается через 8-9 часов от момента попадания бактерии на поверхность растения.
Затем диски отмывают от бактерий жидкой питательной средой с антибиотиком - для элиминации бактерий, немного подсушивают фильтровальной бумагой и помещают на питательные среды для регенерации, содержащие селективный агент для отбора трансгенных регенерантов. Этот метод с незначительными модификациями с успехом применен для генетической трансформации самых разных видов класса двудольных. Долгое время считали, что агробактерии способны трансформировать только клетки голосеменных и двудольных растений, однако недавно появились доказательства их способности трансформировать и однодольные растения, в том числе и злаки. Одной из причин, ограничивающих агробактериальной трансформации злаков, считали неспособность их клеток к синтезу фенольных соединений, которые индуцируют перенос Т-ДНК, однако есть сообщения о синтезе таких сигнальных молекул у однодольных растений. На сегодня с помощью генетической трансформации, опосредованной A.tumefaciens, получены трансгенные растения картофеля, томатов, рапса, хлопка, льна, подсолнечника, сахарной свеклы, люцерны, моркови, сои, баклажана, земляники, винограда, хризантемы, дурмана, осины и тополя, красавки, каланхоэ, табака и другие.
"Прямое переноса генов" имеет ряд преимуществ:
во-первых, исчезает потребность вводить рекомбинантную ДНК в состав плазмидной ДНК;
во-вторых, прямой метод переноса генов эффективен для клеток однодольных.
Впервые трансформированы клеточные линии были получены после обработки изолированных протопластов табака раствором ПЭГ в присутствии Ти-плазмиды и ДНК тимуса теленка.
Оптимизация условий проникновения плазмидной ДНК в изолированные протопласты растений привела к разработке метода электропорации (некоторые авторы называют этот метод електропульсациею), основанный на использовании кратковременных, длительностью от нескольких десятков микросекунд до нескольких десятков миллисекунд, импульсов электрического тока высокого напряжения (от 200 до 1500 В / см) в присутствии ДНК. Хотя механизм, который приводит к усилению проникновения молекул ДНК неизвестен, считают, что в результате електроимпульсации образуются временные транспортные каналы, через которые проникают макромолекулы. Метод электропорации позволил получать генетическую трансформацию с эффективностью от 0,01% до 0,1% от количества протопластов, используемых в опыте. В некоторых случаях эффективность трансформации достигала 10%.
Главным недостатком метода электропорации является необходимость работы с изолированными протопласты, что ограничивает его применение для многих сельскохозяйственных культур.
Одним из способов преодоления этих трудностей является разработка методов генетической трансформации путем микроинъекции ДНК в растительную клетку. Этот метод применяют для трансформации изолированных протопластов, многоклеточных структур (эмбриоидов, меристем, интактного семян) и генеративных клеток растений.
Для микроинъекций используют микроиглы с наружным диаметром 2 мкм и внутренним 1-1,25 мкм. Объем инъекций в каждый протопласт составляет (1-10) 10-4 мл, при концентрации ДНК - 0,1-1,0 мкг / мкл.
Метод упаковки "ДНК в липосомы состоит в инкапсулирования ДНК в сферические тельца с фосфолипидных оболочками, которые сливаются непосредственно с мембраной или поглощаются клетками (эндоцитоз).
Перспективным на сегодня, способ генетической трансформации растений с использованием установки под названием "short gun" - "дробовик", получивший название бомбардировки микрочастицами (particle bombardment), или биолистика - биологическая баллистика (biolistic transformation). Суть метода заключается в том, что на частицы металла (вольфрама или золота) диаметром 0,6-1,2 мкм осаждается ДНК, а затем эти частицы разгоняют в установке и обстреливают растительные ткани. Частицы застревают внутри растительной клетки и затем в этих тканях тестируют транзиентну активность генов, переносятся. Биолистику можно использовать для ввода чужеродной ДНК в суспензию растительных клеток, культуры клеток, меристематических тканей, незрелые зародыши, протокормы, колеоптиль и пыльцу широкого круга растений: кукуруза, пшеница, ячмень, батат, соя, табак, баклажан, рис, рожь, овес и другие (табл. 7). Кроме того, с помощью этого метода были перенесены гены в хлоропласты и митохондрии. Одним из преимуществ генетической трансформации пластидной ДНК очень высокий уровень экспрессии чужеродных генов, что связано с очень большим количеством копий (до 50000) хлоропластной генома в клетке.
Стоит отметить, что на сегодня методы генетической трансформации используют для решения следующих задач селекции: биологическая фиксация азота не бобовыми растениями, повышение эффективности фотосинтеза, создания растений, устойчивых к неблагоприятным факторам среды, гербицидов, болезней и вредителей, повышение качества растительного белка. Уже клонированные и встроенные в геном растений много господарськоцинних генов. Среди них гены, определяющие устойчивость к вирусной инфекции, гербицидам, вредителям, неблагоприятным условиям окружающей среды. Основные проблемы в этой области исследований связаны с выделением генов, кодирующих вышеперечисленные признаки. Тогда как существующие способы генетической трансформации высших растений обеспечивают возможность получения трансформантов почти у любого хозяйственно-ценного вида, хотя условия трансформации требуют оптимизации в каждом конкретном случае.