Раскрытие с помощью рентгеноструктурного анализа пространственного строения ряда ферментов стало главным для построения рациональных схем механизма их действия. В одних случаях эти схемы обосновываются почти
полностью в процессе анализа структуры фермент-субстрат-ных комплексов в кристалле, в других - используются результаты исследований по химической модификации ферментов, кинетики реакций, катализируемых и другие данные. Установление механизма действия ферментов имеет ключевое значение для раскрытия структурно-функциональных связей во множестве биологически активных систем.
В начале XX в. сначала английский химик А.Браун, а затем французский ученый В.Анри высказали предположение, что действие ферментов основывается на образовании фермент-субстратного комплекса, далее распадается с образованием продуктов реакции и высвобождением исходного фермента.
Большую роль в развитии представлений о механизме действия ферментов сыграли классические работы Л.Михаелиса и М.Ментена, которые развивали положение о фермент-субстратных комплексы (1913 г.). Согласно их представлениям, весь процесс ферментативного катализа описывается простым уравнением (рис.31). В процессе ферментативного катализа можно условно выделить три стадии, каждая из которых имеет свои особенности.
Первая стадия - диффузия субстрата к ферменту и стерических связывания его с активным центром фермента с образованием фермент-субстратного комплекса (ФСК). При этом субстрат соединяется с посадочной участком активного центра фермента. Образование ФСК становится возможным благодаря определенной родства ферментов со своими субстратами по типу «замок-ключ». Четко взгляды относительно такого соответствия были высказаны Е.Фишером (1890 г.) во время объяснения специфичности действия ферментов. Сейчас не вызывает сомнения, что между пространственной структурой субстрата и активным центром существует стерически соответствие, но она не является абсолютной. Американский ученый Д.Кошленд выдвинул теорию индуцированного соответствия фермента и субстрата, согласно которой во многих ферментов при отсутствии субстратов функциональные группы активных центров ориентированы таким образом, что их оптимального взаимодействия с комплементарными группами субстрата не происходит. К взаимодействию пространственная структура субстрата и активного центра лишь приблизительно соответствуют друг другу; строгая комплементарность возникает в процессе взаимодействия вследствие изменений конформации (индуцированная соответствие). Конформация молекулы фермента и активного центра может изменяться под влиянием субстрата и кофермента. Доказательством конформационных изменений фермента при связывании субстрата является отличие рентгенограмм свободного фермента и в присутствии специфического ингибитора. На рис.32 схематично показано молекулу фермента с ее функциональными группами А, В и С. Присоединение субстрата к ферменту изменяет структуру активного центра, и его функциональные группы размещаются так, что может происходить реакция.
Первая стадия протекает, как правило, недолго - это зависит от концентрации субстрата и скорости его диффузии к активному центру фермента. Образование ФСК происходит почти мгновенно. Энергия активации этой стадии меняется незначительно. Установлено, что при образовании ФСК молекулы фермента и субстрата не только приближаются, но и определенным образом ориентируются одни относительно других (эффект сближения и ориентации), занимая оптимальное положение относительно каталитического активного центра фермента. В образовании ФСК участвуют ионные, водородные связи и гидрофобные взаимодействия. ФСК очень лабильные, существуют лишь доли секунды, однако, несмотря на это, на сегодня удалось получить ряд ФСК. Так, в 1962 г. японские ученые К.Ячи и Т.Озава получили ФСК оксидазы D-аминокислот и аланина в кристаллическом состоянии.
Вторая стадия - превращение первичного ФСК в один или несколько активированных фермент-субстратных комплексов, обозначенных в уравнении ES "и ЕSxx. Эта стадия конформационных изменений является медленной и вызывает более резкое снижение энергии активации. Здесь происходят взаимодействия субстрата с каталитическим участком активного центра фермента. В этом случае расшатываются связи в молекуле субстрата, наблюдается его дестабилизация и деформация в связи с напряжением, изгибом или натяжением молекулы - так называемый эффект «дыбы». Конформационные изменения способствуют разрыву связи или, наоборот, сближению молекул при реакции синтеза и этим вносят свой вклад в ускорение реакции. Чем больше длина «растягивание» межатомных связей в субстрате, тем меньше энергия его разрыва, т.е. снижается энергия активации. Места деформации легче атакуемых например, молекулами воды.
Третья стадия - выход продуктов реакции из активного центра в окружающую среду. Образуются в процессе реакции продукты имеют другую стерически конформацию, чем субстраты, и легко покидают активный центр. Эта стадия является непродолжительной и определяется скоростью диффузии.
Важной особенностью ферментативной реакции является и то, что превращение субстрата протекает как полифункциональный катализ. Поли-функциональность обеспечивается разнообразием аминокислотных радикалов белковой части фермента и групп кофакторов в активном центре. На химическую связь субстрата влияют несколько групп фермента. В результате этого происходит поляризация преобразуемого связи, а затем его разрыв. Многие группы в активных центрах ферментов функционируют как обобщенные кислоты (доноры протонов) или основания (акцепторы протонов). Особенно эффективно обобщенный кислотно-основной катализ. Он дает увеличение скорости в 10-100 раз. К активному центру обобщенных кислотно-основных катализаторов входят боковые радикалы таких аминокислот, как асп, глу, ГИС, лез, тир и др.. В протонований форме они кислотными катализаторами, непротонований - основными. Обобщенный кислотно-основной катализ невозможно для обычных катализаторов. Для ферментативных реакций большое значение имеет электрофильного-нуклеофильный катализ. В активном центре есть электрофильные (акцепторы электронной пары) и нуклеофильные группы (доноры электронной пары), которые участвуют в акте катализа. Нуклеофильные группы ферментов вступают в реакцию нуклеофильного замещения, что приводит к образованию ковалентных неустойчивых промежуточных соединений. Нуклеофильного группа становится на место заменяемой группы, образуя ковалентную интермедиатов. Он неустойчив и легко распадается на продукты реакции.
Сильным нуклеофилом является имидазольная группа гистидина, поэтому модификация ГИС в составе активного центра приводит к инактивации ферментов. К нуклеофилов относятся также гидроксигруппы сэр, SН-группа ци. Примерами электрофильных групп ионы металлов - Fe3 +, Zn2 + и др.. Ковалентная катализ наблюдается у ферментов, которые образуют ковалентные связи между каталитическими группами активного центра и субстратом. Эти промежуточные комплексы очень неустойчивы и легко распадаются, освобождая продукты реакции.
Одним из примеров ферментативного катализа может служить реакция гидролиза ацетилхолина (АХ) в случае воздействия на него фермента ацетилхолинэстеразы (АХЭ).
Активный центр АХЕ образуется в процессе формирования третичной структуры фермента путем уникального изгиба полипептидной цепи в пространстве. Он включает в сближенном состоянии остатки радикалов аминокислот (в основном, серина, гистидина, тирозина и глутаминовой кислоты), которые обеспечивают непосредственное взаимодействие с молекулой субстрата (посадочная участок), и прямое участие в акте катализа (каталитический участок). Субстратом АХЕ является ацетилхолин, который играет важную роль в передаче нервного импульса с нейрона на нейрон или рабочий орган (мышечное волокно), т.е. АХЕ является нейромедиатором.
Известно, что нервным волокном передается возбуждения (разность потенциалов). Нервное волокно состоит из нервных клеток, которые контактируют между собой в зоне синапса. Электрический импульс передается с одной клетки на другую с помощью химических посредников, получившие название медиаторов. Когда первый импульс достигает пресинаптической мембраны, в ней из специальных пузырьков (везикул) выделяется ацетилхолин, который поступает в синаптической щели. Ацетилхолин действует на постсинаптическую мембрану, где расположены холинорецепторы, с которыми взаимодействует образован ацетилхолин, вызывающий в ней новый нервный импульс, который распространяется дальше.