Дыхательную цепь переноса электронов, как отмечалось выше, имеет три участка фосфорилирования, которое должно отвечать трем протонным насосам. Как результат, в случае переноса двух электронов от НАД-H к
кислороду по дыхательной цепи образуются три молекулы АТФ, а в случае переноса электронов от ФАД-дегидрогеназы-две молекулы АТФ.
Основные звенья трансмембранного переноса протонов и электронов в митохондрии изображенные на схеме (рис. 59). Из схемы следует, что первый перекрест начинается на участке от НАД-H к КОО (убихи-нона). Как уже отмечалось, на внутренней поверхности внутренней мембраны расположена НАД-дегидрогеназа или ФАД-дегидрогеназа с активным центром, направленным к матрикса, откуда они получают соответствующие субстраты. Здесь осуществляется процесс дегидрирования субстратов с образованием НАД • H + H +; атомы водорода от него поступают в флавопротеинов (ФП). В состав последних входит ФМН и зализосир-чаний белок с негеминовых железом (FeS-ПР ^, который принимает электроны, а 2H + перебрасываются на внешнюю сторону мембраны. Следовательно, здесь освобождается первая пара протонов, а два электрона транспортируются через FeS-ПР1 к КОО. КОО, присоединяя электроны, приобретает отрицательный заряд и одновременно захватывает протоны из матрикса митохондрий. Это сопровождается образованием KoQ-H2 и отрицательного заряда на внутренней поверхности мембраны.
Второй перекрест имеет место на участке от KoQ-H2 в цитохрома с1. Восстановленный KoQ-H2 диффундирует через мембрану к наружной поверхности, где расположен цитохром b и зализосирчаний белок (FeS-ПР ^. На внешней поверхности окисления KoQ-H2 сопровождается переходом второй пары 2H + в среду и возвращением двух электронов на FeS-ПР ^ а затем в вторую молекулу КОО. При этом статистика, присоединяя два электрона, приобретает отрицательный заряд и захватывает еще 2H + из матрикса.
Третий перекрест начинается, когда снова переносит на-
внешне третью пару протонов, а два электрона ^ О-H через цитохромы с1 и c передаются на цитохромоксидазу (а-а3), где заканчивается третья, электронная петля. На цитохромоксидазы, активный центр которой обращен к матрикса, происходит передача электронов на молекулярный кислород по уравнению: 2е-+ 1/2O2 + 2H + ^ H2O. Ионы Ы + для образования гидроксильных ионов и молекул воды поступают из матрикса митохондрий.
Итак, окисления НАДЫ2, начавшись на внутренней поверхности, заканчивается после троекратного пересечения мембраны протонами и электронами восстановлением кислорода и образованием воды тоже на внутренней поверхности мембраны митохондрий. Источником шести протонов является: два Ы + от субстратов окисления (находящихся в составе НАДЫ2) и четыре Ы + из среды матрикса. Источниками электронов, которые используются для восстановления кислорода, есть только НАД Ы2 или, в случае ФАД-де-гидрогеназы, - ФАДЫ2, образующиеся при дегидрировании субстратов.
Механизм фосфорилирования. Согласно хемиосмотичною концепцией протоны, выведены наружу за счет энергии переноса электронов, в случае их избытка на внешней стороне внутренней мембраны снова направляются в митохондриальный матрикс. Однако внутренняя мембрана непроницаема для них, за исключением специального участка - протонных каналов. В зоне этих каналов находится Ы +-АТФ-синтетаза, которая является протонным насосом, обеспечивающим переход Ы + из зоны с более высокой (внешняя сторона внутренней мембраны) в зону с более низкой концентрацией (в матрикс), что сопровождается выделением свободной энергии, за счет которой и синтезируется АТФ. В настоящее время окончательно установлено, что комплекс Ы +-АТФ-синтетазы, встроенный в мембрану, представляет собой простейшую систему, способную осуществлять взаимопревращения энергии АТФ и ДцЫ +. Как уже отмечалось, внутренняя мембрана пронизана выростами грибовидной формы, которые и представляют собой АТФ-синтетазной комплекс, состоящий из двух структурных частей. «Ножка гриба» (фактор F0) в виде белкового цилиндра пронизывает всю толщу внутренней мембраны (рис. 59 и рис. 60), один конец которого сообщается с внешней средой, а второй выходит в матрикс в виде головки с активным центром и обозначается как фактор F1. Итак, Ы +-АТФ-синтетазу можно обозначить как F0 + F1. Строение, свойства и функции этих двух частей фермента совершенно разные. Общая масса F0 + F1 примерно равна 500000 дальтон, из них на F1 приходится около 340000, а на F0 - остальная масса. F0 - очень гидрофобный белок, который состоит из четырех полипеп-тидних цепей. F1 состоит из десяти субъединиц - полипептид-ных цепей пяти различных типов (а, ß, у, 5, есть). F0 выполняет функцию канала в мембране, через который проходят протоны, а F1 - фосфорилю-ючу функцию при синтезе АТФ. Этот спряжуючий фактор может вызвать при определенных условиях и гидролиз АТФ, поскольку может находиться в двух взаемоперетворюваних состояниях, равновесие между которыми контролируется соотношением количеств АТФ и АДФ в митохондриях.
Распределение функциональных особенностей между субъединицами - вопрос дискуссионный. Предполагают, что aß-композиция формирует каталитический центр фермента, у-и 5-полипептиды обеспечивают связывание F1 и F0, а есть-субъединица является воротами протонного канала. Таким образом, АТФ-синтетазной комплекс функционирует как единая система, преобразуя энергию, которая содержится в электрохимическом градиенте ионов Ы +, в фосфатный связь молекулы АТФ. АТФ из АДФ и фосфата прекращается, и через канал Fx проходят протоны по градиенту их концентрации. Добавление Fx «запечатывает» протонный канал и восстанавливает способность к синтезу АТФ, сопряженного с клеточным дыханием. Итак, через F0 поставляются протоны к активному центру Fb который располагается вблизи протонпроводящих пути, где и происходит синтез АТФ.
В каталитическом центре фермента электрическое поле, которое создается дыханием, смещает равновесие системы
АДФ3 + + РО43-+ 2Н + АТФ4-в сторону синтеза АТФ.
Последовательность молекулярных преобразований на заключительном этапе процесса фосфорилирования точно не выяснена. Предложено два гипотетических механизмы. В основе модели П. Митчелла лежит предположение о непосредственном участии ионов водорода в фосфорилирования АДФ в активном центре фермента. Ионы водорода, используя энергию электрохимического потенциала, проходят протонный канал комплекса F0, попадая в активный центр Fx-компонента, где реагируют с атомом кислорода неорганического фосфата. Как результат образуется реакцийноз-пригоден фосфатное производное, которое непосредственно взаимодействует с АДФ, фосфо-рилюючы его. В других случаях ведущая роль принадлежит изменениям пространственной структуры Fx-АТФ-синтетазы. Считают, что энергия протонного потенциала расходуется на индукцию конформационных перестроек в белковых цепях Fx-комплекса, что приводит к формированию каталитических центров в молекуле фермента для связывания АДФ и фосфата, а следовательно, и к синтезу АТФ.
Клетка использует АТФ, синтезированный в митохондриях, как химическое топливо при различных энергозатратах. Поэтому митохондриальный АТФ необходимо доставить в ту часть клетки, где он необходим. Также необходимо поступления субстрата фосфорилирования АДФ и донора фосфатной группы в митохондрии. Свободная диффузия этих метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий невозможна благодаря ее непроницаемости для гидрофильных молекул, таких как АТФ4-, АДФ3,-Р043-. Эта проблема решается благодаря существованию в липидном би-слое двух специализированных белковых транспортных систем: транслока-зи фосфата, которая доставляет его в матрикс, и транслоказы адениловых нуклеотидов (АДФ-АТФ-транслоказы), которая переносит АДФ3-в Мито-хондрии, а АТФ4 - в цитоплазму (рис.59).
Система АДФ-АТФ-транслоказ высокоспецифического. Она не способна переносить другие нуклеотиды. Проявление ее биологической активности связан с конформационными переходами комплекса. В одной конформации связывающая участок доступна со стороны цитоплазмы и взаимодействует с АДФ, в другой-связывающим АТФ на противоположной стороне. Если на поверхности внутренней мембраны потенциал отсутствует, транслоказа переносит оба нуклеотиды с равной эффективностью в обоих направлениях. Наличие положительного мембранного потенциала на внешней стороне бислоя делает невозможным перенос АТФ4-внутрь, а АДФ3-- наружу. Таким образом, мембранный потенциал определяет физиологически необходимое направление движения-захват АДФ из цитоплазмы и выброс в это же среду АТФ.
Важным моментом является оборачиваемость реакции, катализируемой АТФ-синтетазной комплексом. При соответствующих условиях комплекс F1-F0 может расщеплять молекулу АТФ и использовать полученную при этом энергию для скачивания протонов, т.е. для образования на мембране электрохимического потенциала ионов водорода. Итак, катализируя обратную реакцию распада АТФ, H + ^ ТФ-синтетаза работает как H +-АТФаза (протонная аденозинтрифосфатаза), откачивая протоны из внутреннего пространства наружу за счет энергии гидролиза АТФ. Протонные АТФазы, которые были выделены из митохондрий животных, высших растений и грибов, хлоропластов и некоторых бактериальных клеток, имеют одинаковый тип строения и, вероятно, один и тот же механизм функционирования.