План:
1. Биология возбудителя дифтерии.
2. Бровары, их характеристика.
3. Токсинообразование. Методы определения токсигенности.
4. Лабораторная диагностика дифтерии.
Открытию возбудителя дифтерии предшествовали широкие клинические, патологоморфологические, эпидемиологические и экспериментальные исследования, которые в значительной ми ¬ рой подготовили почву для его обнаружения (Э. Клебс, 1883), выделение в или ¬ стой культуре (Ф. Леффлер, 1884), изготовление токсина (Э. Ру и А. Иерсен, 1888), антитоксической сыворотки (Э. Беринг, С. Китазато, 1890; Э. Ру, 1894) и дифтерийного анатоксина (Г. Район, 1923).
Морфология. Коринебактерии дифтерии (пленка, кожа) - прямые или чуть изогнутые палочки длиной 1-8 мкм и шириной 0,3-0,8 мкм, полиморфные, грамположительные, лучше окрашиваются у полюсов, на которых расположены метахроматические гранулы (зерна Бебеша - Эрнста). В коринебактерий дифтерии является на концах булавовидные утолщения, иногда появляются ветвистые и нитевидные формы, а также почти коккообразные и дрожжеподобные. В мазках они располагаются под углом, приобретая вид растопыренных пальцев, не образуют спор, капсул и жгутиков. В коринебактерий дифтерии выявлены фимбрии или подобные образования, предоставляют микроорганизмам адгезивной активности. В период макси ¬ мального выделение экзотоксина видно мембранные структуры в виде овалов, колец. Цитоплазма гранулярная. На ультратонких срезах клеточная стенка имеет два слоя: внутренний с тонкими осмофильных фибриллами. Метахроматические гранулы состоят из твердых зернистых образований, окруженных мембраной. При старении цитоплазма коринебактерий дифтерии приобретает «зебровиднои» (полосатой), неравномерно окрашивается, формы.
Культивирование. Возбудитель дифтерии - аэробных или факультативный анаэроб, оптимальная температураросту 37 ° С (крайние границы 15 и 40 ° С), рН среды 7,2-7,6; хорошо культивируется на средах, содержащих белок (свернувшаяся сыворотка крови, кровяной агар , сывороточный агар), а также на сахарном бульоне. На среде Ру (свернувшаяся сыворотка крови лошади) и се ¬ ды Леффлера (три части бычьей сыворотки и одна часть сахарного бульона) коринебактерии дифтерии развиваются в течение 16 - 18 суток, рост их напоминает шагреневую кожу, колонии между собой не сливаются.
Рис. Колонны коринебактерий дифтерии:
По культуральным свойствам коринебактерии дифтерии подразделяются на биоваров гравис, интермедиус и Митис (в последнее время к ним добавилась и К.белфанти)
Коринебактерии гравис на теллуритовый агаре, содержащий Дефибринированную кровь и теллурит калия, образуют крупные шероховатые (R-формы) розеткоподибни колонии
черного или серого цвета. Они ферментируют декстрин, крахмал и гликоген, в бульоне образуют поверхностную пленку и зернистый осадок, конечно высокотоксичные и имеют более выраженные инвазивные свойства. Коринебактерии Митис на теллуровых агаре растут с образованием темных гладких (S-формы) блестящих колоний. Они не ферментируют крахмал и гликоген, непостоянно ферментируют декстрин, вызывают гемолиз эритроцитов всех видов, в бульоне дают диффузное помутнение, менее токсичные и инвазивные.
Ферментативные свойства. Коринебактерии дифтерией нельзя зсидають молоко, не разлагаются мочевину, не выделяют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитриты, а также теллурит калия до металла, в результате чего колонии возбудителя дифтерии в теллуровых агаре становятся черными или серыми. Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу и мальтозу, непостоянно - галактозу, крахмал, декстрин, глицерин.
Токсинообразование. Коринебактерии дифтерии продуцируют в бульонных культурах сильные экзотоксины (гистотоксин, дермонекротизин, гемолизинов). Токсигенность коринебактерий связана с лизогеннистю (наличием в токсигенных штаммах умеренных фагов - профагов). Генетические детерминанты токсигенности (тох +-гены) локализованы в геноме профага, интегрированного с нуклеоидом коринебактерий дифтерии.
Дифтерийный экзотоксин состоит из двух (А и В) полипептидных цепей, соединенных дисульфидными мостиками. Под влиянием восстановительных агентов расщепляются дисульфидные связи, соединяющие А-и В-цепи. А-цепь переходит в цитоплазму, а В-цепь остается в мембране и вызывает связывание токсина с рецепторами на поверхности клеток. Токсигенные штаммы коринебактерий дифтерии рядом с лизогеннистю характеризуются выраженной дегидрогеназную и нейраминидазною активностью. Дифтерийный токсин неустойчив, легко разрушается под воздействием температуры, света и кислорода воздуха, но сравнительно резистентный к действию ультразвука. После добавления к токсину 0,3-0,4% формалина и последующего выдерживания при температуре 38-40 ° С в течение 3-4 недель он превращается в анатоксин, который имеет большую устойчивость к физическим и химическим воздействиям, чем исходный токсин.
Антигенная структура. С помощью реакции агглютинации у возбудителя дифтерии выявлено 11 сероваров.
Токсины, образующиеся различными штаммами, не имеют специфичности и полностью нейтрализуются стандартным дифтерийным антитоксином. Доказано, что в коринебактерий дифтерии является вариантоспецифични термолабильны поверхностные белковые антигены (К-антигены) и группоспецифические термостабильные соматические полисахаридные антигены.
Среди коринебактерий различают 15 фаговаров, с помощью которых выявляют источники инфекции: фаговары учитывают также при идентификации выделенных культур.
Резистентность. Коринебактерии дифтерии сравнительно устойчивы к воздействию факторов внешней среды. На осадочной сыворотке они остаются жизнеспособными около года, при комнатной температуре - до 2 месяцев, на детских игрушках - несколько суток. Коринебактерии долго сохраняются в пленках больных дифтерией. От действия температуры 60 ° С и 1% раствора фенола возбудитель дифтерии погибает в течение 10 мин.
Патогенность для животных. В естественных условиях вирулентные коринебактерии дифтерии выявлены у лошадей, коров, собак, инфицированных, от людей, больных дифтерией и носителей. Однако домашние животные не являются источником заражения человека.
С лабораторных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При заражении культурой или токсином коринебактерий у них развивается типичная картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. Внутренние органы гиперемированы, в надпочечниках наблюдаются кровоизлияния. Доза 0,06 мкг токсина убивает морскую свинку массой 250 г.
Патогенез заболевания у человека. Источником инфекции являются больные дифтерией и носители. Заболевание передается воздушно-капельным путем, иногда с частицами пыли, возможна передача через различные предметы (игрушки, посуда, книги, полотенца, платки и т.д.), пищевые продукты (молоко, различные холодные блюда и др.)., Инфицированные коринебактерий дифтерии . Важную роль в эпидемиологии дифтерии играют носители, в среднем их количество среди реконвалесцентов и здоровых лиц составляет 3-5%. Самая высокая заболеваемость дифтерией бывает осенью, что объясняется увеличением скученности детей в это время года и снижением сопротивляемости организма под влиянием охлаждения.
Ведущую роль в патогенезе дифтерии играет гистотоксин, который блокирует синтез белков в клетках организма больных, инактивирует фермент трансферазу, ответственную за образование полипептидной цепи. Благодаря наличию диффузного фактора контролируется бактериальными генами, коринебактерии дифтерии имеют свойство проникать в органы и ткани больных людей. Бактериемия бывает у лиц с нарушенным иммунологическим состоянием. Диффузный фактор представляет собой гиалуронидазу, который имеет свойство расщеплять гиалуроновую кислоту. К факторам инвазийности принадлежат нейраминидаза, некротический фактор, плазмин.
Определенное значение в развитии дифтерии имеет адгезия, благодаря которой возбудитель дифтерии адсорбируется на рецепторах не только клеток слизистых оболочек и кожи, но и других органов и тканей. В клинике и в эксперименте на животных доказано влияние на развитие заболевания патогенных стафилококков и стрептококков, продуцирующие токсины и факторы инвазийности, что в значительной степени усиливает тяжесть инфекции.
У человека на месте внедрения возбудителя дифтерии (нос, зев, трахея, конъюнктива глаза, кожа, наружные половые органы, раневая поверхность) образуется пленка, имеет много коринебактерий дифтерии и других микроорганизмов.
Продуцируемый возбудителем дифтерии экзотоксин вызывает некроз и дифтерийное
воспаление слизистых оболочек или кожи; всасываясь, он поражает нервные клетки, миокард и паренхиматозные органы, с умовлюе явления выраженной интоксикации. Глубокие изменения происходят в миокарде, сосудах, надпочечниках, а также в ЦНС и ПНС.
По локализации процесса чаще наблюдаются дифтерия зева и дифтерийный круп, потом дифтерия носа. Сравнительно редко встречается дифтерия кожи, глаз, ушей, наружных половых органов. На дифтерией зева приходится более 90% всех случаев заболеваний, второе место занимает дифтерия носа.
Иммунитет. При дифтерии неблагоприятное зависит, главным образом, от содержания в крови анатоксина. Клеточные реакции обеспечивают защиту организма от возбудителя, который не поддается обезвреживанию действием антитоксина. Доказана роль опсонинив, которые усиливают фагоцитоз. Хемотаксические факторы, фракции комплемента способствующих развитию воспалительной реакции, происходит активация макрофагов, осуществляющих внутриклеточное переваривание. Иммунитет при дифтерии имеет антиинфекционной (антитоксическое и антибактериальный) характер.
Наличие противодифтерийной антитоксической иммунитета обнаруживают с помощью реакции Шика. При этом вводят морской свинке в предплечье внутрикожно 0,2 мл. В случае положительной реакции, которая свидетельствует об отсутствии антитоктоксичного иммунитета, на месте введения через 24-48 ч появляется гиперемия и припухлость диаметром до 2 см. Положительная РШ наблюдается при отсутствии антитоксина или незначительном количестве его в сыворотке крови. В связи с тем, что дифтерийный экзотоксин вызывает состояние сенсибилизации и приводит у многих детей розвитох тяжелых осложнений, РШ теперь используют ограниченно.
Для определения количества антитоксина в крови рекомендуется РНГА с эритроцитами, сенсибилизированными дифтерийным анатоксином. Наиболее восприимчивы к дифтерии дети 1-4 года.
В последнее время обнаружено относительное увеличение заболеваемости и среди взрослых.
Лабораторная диагностика. Объектом исследования является выделение зева носа, иногда вульвы (наружных половых органов), глаз, кожи, которые берут стерильным ватным тампоном.
Материал, предназначенный для исследования, высевают на специальные среды - свернувшуюся сыворотку крови, кровяное теллуритовый агар и т.д..
Через 12-24 - 48 ч культивирования делают бактериоскопию мазков. По результатам микроскопии дают предварительный ответ.
Коринебактерии дифтерии не всегда бывают морфологически типичными. В ряли случаев возбудитель принимает форму коротких палочек со слабо выраженной зернистостью, расположенных не под углом, а беспорядочно.
Чаще ошибки бывают в тех случаях, когда исследование ограничивается только методом бактериоскопии.
Случается, что коринебактерий дифтерии ошибочно считают другие виды или непатогенные коринебактерии, похожие на дифтерийные. Кроме того, гранулы волютина образуются не всегда и, следовательно, этот признак не абсолютна. Наиболее весомым, но не единственным критерием дифференциации патогенных коринебактерий является токсинообразования. Поэтому лабораторную диагностику дифтерии осуществляют выделением чистой культуры и идентификации ее по культуральным, биохимическим, серологическими и токсигенными признакам.
Дифференциацию токсигенных и нетоксигенных штаммов коринебактерий дифтерии проводят путем подкожного или внутрикожного заражения морских свинок или методом преципитации в агаре. Последний способ сравнительно доступный и может быть применен в любой лаборатории.
Образование преципитатов токсигенными культурами коринебактерий.
Он основан на свойстве дифтерийного экзотоксина вступать в соединение с антитоксином и образовывать преципитаты в виде стрел-усиков. Токсигенность можно выявлять заражением монослойных клеток, чувствительных к экзотоксина коринебактерий дифтерии. Выявить дифтерийный экзотоксин можно в ИФА с помощью моноклональных антител из набора «Дифтерия-моноз». Для выявления иммуноглобулинов класса G к бактериальному антигена используют ИФА.
Лечение. После установления клинического диагноза больным дифтерией вводят антитоксическую дифтерийную сыворотку (10000 - 20000 МЕ при формах средней тяжести и ЗО 000-50000 МО при тяжелых формах заболевания), антибиотики (пенициллин, эритромицин) и сульфаниламидные препараты. Антибиотики меняют дисперсионные и диффузионные свойства экзотоксинов коринебактерий дифтерии, стафилококков и стрептококков и тем самым снижают их токсичность.
Для повышения иммунобиологической состояния организма - выработка собственного антитоксина - рекомендуется вводить дифтерийный анатоксин. Для лечения носителей назначают антибиотики. Хорошие результаты дает применение эритромицина в сочетании с аскорбиновой кислотой.
Профилактика заключается в ранней диагностике инфекции, немедленной госпитализации
больных, полноценной дезинфекции помещения и предметов, выявлении носителей. В эпидемическом очаге, где были выявлены случаи дифтерии; течение 7 суток ведут медицинское наблюдение. В ряде зарубежных стран всем лицам, контактным по дифтерии, вводят 1000 МЕ дифтерийного иммуноглобулина. Специфическую профилактику осуществляют активной иммунизацией. Есть несколько видов вакцин, используют для специфической профилактики дифтерии:
• адсорбированный дифтерийный анатоксин (АД-анатоксин);
• адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин (АДС-анатоксин рус. АДС-анатоксин);
• адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС-вакцина рус. АКДС-вакцина).
Одним из существенных недостатков специфической профилактики дифтерии является то, что применение анатоксина приводит к созданию антитоксического иммунитета, обусловленного главным образом нейтрализацией экзотоксин, а не повреждением возбудителя заболевания, и не предотвращает носительства токсигенных и нетоксигенных коринебактерий у привитых детей.
В связи с необходимостью воспроизводства у привитых одновременно гу ¬ морального и клеточного иммунитета, который обеспечивает нейтрализацию экзотоксина и угнетение возбудителя заболевания, целесообразно вести дальнейшие научные поиски для создания такого антигена, который бы обеспечивал выработку антиинфекционной иммунитета против дифтерии.