Наиболее частыми возбудителями стрептококковых заболеваний являются: S.pyogenes, S. agalactiae, S. bovis, стрептококки
группы C и G, которые входят в семьи Streptococcaceae, рода Streptococcus.
Материалом для исследования навоз, отделяемое из зева и носа, ликвор, мокрота, кровь, моча, содержимое везикул, пустул.
Материал отбирают одноразовым шприцем или стерильным ватным тампоном, который помещают в пробирку с транспортным питательной средой (СКС- среда для контроля стерильности).
Кровь для бактериологического исследования в объеме 5-10 мл засевают в сахарный бульон непосредственно у постели больного таким образом, чтобы соотношение крови и питательной среды было бы не менее 1:10 - 1:20. Срок передачи патологического материала в бактериологическую лабораторию не должен превышать двух часов.
Микробиологическую диагностику стрептококковых заболеваний проводят микроскопическим, бактериологическим и серологическим методами.
Микроскопический метод. Из материала, который исследуется готовят мазок и красят его по Граму. При микроскопии в мазке обнаруживаются грамположительные кокки, которые располагаются короткими цепочками, иногда попарно или в виде единичных кокков. На основе изучения морфологических и тинкториальных свойств невозможно определить род выявленных в препарате микробов.
Для выявления патогенного стрептококка, в полученном от больного клиническом материале, используют реакцию имунофлюоресценциии (РИФ). В этом случае используют специфические сыворотки, в которых антитела против стрептококков замечены флюорохромом (см. Приложение).
Бактериологический метод является основным в диагностике стрептококковых заболеваний. Взят для исследования материал высевают в среду обогащения, в качестве которого используют среду для контроля стерильности (СКС). После инкубации в термостате материал, исследуется пересевают сахарным бульон и на 5% кровяной агар с целью выделения чистой культуры микробов, изучение культуральных свойств и характера его гемолиза. Посевы помещают в эксикатор с плотно притертой крышкой и зажженной внутри свечой, или в анаэростатах, где создают повышенную концентрацию двуокиси углерода. Инкубируют в термостате при температуре 37 ° С в течение 18-24 часов. На сахарном бульоне S. pyogenes дает придонно- пристеночный рост с образованием мелкозернистого осадка и сохранением полной прозрачности среды. S. bovis вызывает интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого гомогенного осадка. В изготовленных из бульонной культуры мазках стрептококки располагаются обычно в виде типичных для них длинных цепочек.
На кровяном агаре стрептококки образуют мелкие (1-2 мм в диаметре) прозрачные или полупрозрачные колонии серовато-белого цвета. По типу гемолиза на кровяном агаре стрептококки разделяют на три группы.
Первая группа представлена β-гемолитическими стрептококками, способными вызвать полный лизис эритроцитов (полное просветление среды) вокруг колоний. Колонии прозрачные, слизистые, круглой формы, напоминают капли росы. Это характерно для свижовидилених штаммов S. pyogenes. Блестящие колонии характерны для многих штаммов S.agalactiae.
Вторая группа представлена α-гемолитическими стрептококками, которые вызывают на кровяном агаре неполный гемолиз в виде полупрозрачной зоны зеленоватого оттенка. Зеленящий стрептококки растут в виде мелких колоний серого цвета с гладкой или шероховатой поверхностью. Такой рост характерен для многих видов стрептококков, вегетирующих на слизистой оболочке полости рта (S.salivarius, S. mutans, S.oralis и др.)
Третья группа представлена негемолитическая γ-стрептококками. Они не вызывают изменений кровяного агара в процессе своего роста, имеют слабо выраженную вирулентность.
С подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микро- вскапывают. Колонии, выросшие на кровяном агаре, пересевают на скошенный кровяной агар. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 ° С в течение 18-24 часов. С целью проверки чистоты выделенной культуры, с микробного налета, вырос на скошенном агаре готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. В случае, когда культура микробов чистая, продолжают изучать их биохимические и антигенные свойства. Для установления видовой принадлежности стрептококков наибольшее значение имеют следующие тесты: тип гемолиза на кровяном агаре, проба на каталазу, чувствительность к бацитрацину и сульфаниламидов (сульфаметоксазола и триметоприма), желчно-ескулиновий тест, рост в бульоне с 6,5% NaCl, наличие пиролидонилариламидазы (PYR), гидролиз гипурату натрия.
Проба на каталазу. Тест основан на способности микроорганизмов, которые имеют этот фермент, расщеплять перекись водорода с образованием кислорода и воды. Для постановки этого теста чистую культуру помещают в каплю 3-10% раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями. В положительном случае наблюдают выделение пузырьков газа. В отличие от стафилококков, стрептококки не имеют этого фермента.
Проба с бацитрацином и сульфаниламидами. Для предварительной идентификации S.pyogenes и β-гемолитических стрептококков групп C и G используют два бумажных диска, один из которых пропитан раствором антибиотика бацитрацином, а второй - смесью сульфаметоксазола и триметоприма. Диски помещают на чашку с кровяным агаром, усеянным культурой, которую испытывают и инкубировать 18-24 часа в аэробных условиях. Любая видимая зона задержки роста вокруг дисков интерпретируется как чувствительна к этим антимикробных препаратов. Абсолютное большинство штаммов S. pyogenes чувствительна к бацитрацину, а стрептококки групп С и G - к сульфаниламидов.
Желчно-ескулиновий тест. Используется для предварительной идентификации стрептококков S.bovis, которые растут на желчно-ескулиновому агаре с образованием колоний темно-коричневого или черного цвета.
Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. S.agalactiae в отличие от других стрептококков устойчив к высокой концентрации хлористого натрия и дает рост в бульоне через 24-48 часа инкубации в термостате при температуре 37 ° С.
PYR - тест. В основе теста лежит выявление фермента пиролидониламидазы, которая у большинства штаммов S. pyogenes и не встречается в других стрептококков. Культуру, которую исследуют, петлей вносят в питательную бульон содержит 0,01% L-пиролидонил-β-нафтиламиду и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 4:00. После добавления одной капли диметиламиноациннамальдегида в положительном случае появляется ярко-красную окраску.
Гидролиз гипурату натрия. В основе данного теста лежит способность S. agalactiae вызвать гидролиз гипурату натрия. Выделенную чистую культуру с помощью петли диспергируют в 1% водном растворе гипурату натрия. Через 2:00 инкубации при температуре 37 ° С добавляют 3,5% раствор нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1: 1). При положительном результате после инкубации в течение 10 мин. появляется пурпурное окрашивание.
Дифференциация стрептококков по антигенной структуре. Основывается на выявлении полисахаридного антигена клеточной стенки стрептококка. Например применяют реакцию преципитации с группоспецифической сыворотками групп А, В, С, G. Эти сыворотки наливают в 4 узкие преципитацийни пробирки. Экстракт, полученный после обработки центрифугата чистой культуры стрептококка раствором хлористо-водородной кислоты, осторожно, не смещая жидкости, наслаивают на группоспецифические сыворотки. При положительной реакции на границе двух жидкостей появляется белое кольцо. Конечно реакция преципитации возникает через 5-30 мин.
Серологический метод диагностики стрептококковых заболеваний нашел применение в случае установления диагноза ревматизма. Для этого в сыворотке крови больного определяют титр антител к экстрацеллюлярного продуктов стрептококка - стрептолизина-О. Исследуют парные сыворотки больного с интервалом 7-10 дней. Препарат стрептолизина-О, который выпускают в сухом виде, растворяют и вносят в каждую пробирку с разбавленной сывороткой. В день постановки опыта готовят 5% взвесь эритроцитов дефибринированной крови кролика и также вносят в каждую пробирку.
Реакция базируется на нейтрализации способности стрептолизина-О растворять эритроциты in vitro в случае присутствия в сыворотке больного антител против стрептококка (Антистрептолизин-О). Максимально разведенная сыворотка в пробирке обеспечивает задержку гемолиза эритроцитов и указывает на соответствующее количество антистрептолизина-О.
Титр Антистрептолизин-О у практически здоровых лиц не превышает 250 международных единиц. При острых и хронических стрептококковых инфекциях он нарастает, причем при наличии ревматизма или нефрита с первых дней заболевания отмечается очень высокий титр антител (500 ед. И выше).