Возбудитель Vibrio cholerae входит в семью Vibrionaceae, рода Vibrio. Наибольшее значение в патологии человека имеют 2 биоварами: V. cholerae и V. Eltor.
Материалом для исследования от больных является стул и рвотные массы, а от вибрионосителей - стул В ру, погибших от холеры исследуют тонкий кшечник и желчный пузырь (секционный материал). С Объекта окружающей среды изучается вода открытых водоемов и воды стоков.
В микробиологической диагностике холеры используют экспресс-метод, бактериологический и серологический методы.
Экспресс-метод диагностики. Позволяет выявить холерный вибрион непосредственно в материале, который исследуется. Для этого используют РИФ (см. Приложение).
Для быстрого обнаружения холерного вибриона используют также РОПГА с антительным эритроцитарных диагностикумом и цепную полимеразной реакции (ПЦР). (См. Приложение). Бактериологический метод. Является основным методом диагностики холеры. Выделение чистой культуры вибриона и его идентификацию проводят круглосуточно в специализированной лаборатории. Окончательный ответ должен быть предоставлен через 36 часов от начала исследования.
При проведении бактериологического метода диагностики необходимо соблюдать следующие требования.
1. Посев материала лучше выполнять у постели больного, поскольку холерный вибрион плохо сохраняется в испражнениях больных и носителей.
2. Посуда, в который собирают исследовательский материал, не должен обеззараживанию химическими веществами, поскольку вибрион к ним очень чувствителен.
3. Необходимо исключить возможность заражения окружающих и загрязнения объектов окружающей среды.
Висел стула или иного материала, который исследуется выполняют у постели больного или непосредственно на месте отбора материала на 1% щелочную пептонную воду (ПВ) и доставляют в специализированную лабораторию с соблюдением всех правил безопасности в сопровождении медицинского персонала. После 6 часовой инкубации высева на 1% пептонной воде образуется хрупкая пленка с немного голубым оттенком, которая во время встряхивания пробирки легко разрушается и оседает на дно.
Изготовлен из пленки мазок по Граму, микроскопируют. Кроме того содержание пленки изучают под микроскопом в препарате «висящая» или «раздавленная» капля и ставят с ним реакцию агглютинации на стекле с О-холерной сывороткой. Возбудители холеры грамотрицательные, имеют палочковидную форму, слегка изогнутые, подвижные.
Независимо от полученного результата, исследования продолжают по следующей схеме: содержание пленки пересевают второго 1% щелочную ПВ и щелочной МПА или среду TCBS, которое является лучшим селективным средой для холерных вибрионов, поскольку сопутствующая флора на нем не растет. На фоне голубовато-серого цвета этой среды образуются колонии холерных вибрионов с желтым оттенком. Вторую ПВ инкубируют 6:00 при t 37 ° С и проводят исследования по той же схеме.
В случае выявления в пленке грамотрицательных подвижных палочек, которые аглютинуються О-холерной сывороткой, делают предварительный вывод, что обнаружен холерный вибрион, и продолжают исследования дальше. Со второй ПВ делают еще раз пересел на щелочной МПА.
Подозрительными считают мелкие, гладкие, стекловидное-прозрачные колонии с едва заметным голубоватым оттенком, которые выросли за 12:00 на щелочной МПА.
Чистую культуру выделяют на лактозо-цукрозному среде и культивируют 12:00 при t 37 ° С. Отбирают колонии и ставят пробу на оксидазу. При культивировании на элективных средах проба на оксидазу не делается.
Идентификация чистой культуры проводится по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, подвижностью и окончательным типированием с помощью диагностических агглютинирующих сывороток О, OR, Инаба, Огава и бактериофагов.
Окончательный ответ об обнаружении того или иного биовара холерного вибриона возможна при:
1. Выявленные подвижных грамотрицательных немного изогнутых палочек, которые выросли в пленке через 6:00 инкубации на второй ПВ;
2. Выявленные мелких, стекловидное прозрачных колоний, выросших из 12:00 на щелочной МПА и дают положительную реакцию на оксидазу;
3. Изменения цвета лактозо-цукрозного среды в нижней части «столбика» без наличия пузырьков газа;
4. Ферментации углеводов: сахарозы (+), арабинозы (-), маннозы (+).
5. Положительному феномене агглютинации с О-и OR- холерными сыворотками Инаба и Огава.
Серологический метод. Носит вспомогательный характер. Обнаруживают специфические антитела в сыворотке крови больного в РА, РПГА, ИФА, РИФ (косвенная). Токсиннейтрализуючи антитела появляются на 5-6 день болезни и достигают максимума на 14-21 сутки. Диагностическим титром в РПГА считается разведение 1: 160.